先天性巨细胞病毒感染胎儿7例的临床与尸检特征分析

王景美,余慧萍,林晓倩,陈 玲,吴鸿雁,茹 彤,胡娅莉,孟凡青

人类巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是引起宫内感染常见的病原微生物之一,可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内生长受限及多发畸形等[1]。CMV通过垂直转播血行感染胎儿,胎儿的各脏器组织均可能累及,包括中枢神经系统、泌尿系统、生殖系统、呼吸系统及消化系统等器官,对胎儿造成不同程度危害,幸存者可能出现严重的后遗症[2]。目前,国内仅见1例先天性CMV感染尸检的病例报道[3]。本文回顾性分析7例先天性CMV感染胎儿的临床及尸检特征,以提高先天性CMV感染对胎儿严重危害的认识。

1 材料与方法

1.1 材料收集2012年5月～2018年12月南京大学医学院附属鼓楼医院产科送检的7例先天性CMV感染的围产儿尸体解剖标本,包括胎儿及胎盘。

1.2 方法测量并记录胎儿的各项体表参数,包括体重、顶臀长、身长、足长、手长、头围、胸围、腹围、内眦间距、乳头间距等,进行外观检查并描述。解剖内部脏器,肉眼观察并脏器称重。各脏器(包括消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、内分泌脏器及脑组织等)及胎盘常规取材及组织学切片、HE染色,行组织病理学观察和评估。胎儿外观及异常内部脏器拍照并留存。

CMV感染诊断标准:组织学可见典型CMV包涵体[4],和(或)胎儿肾脏CMV DNA阳性[5-6]。HE切片观察到典型的病毒包涵体,并经免疫组化染色证实。CMV抗体购自北京中杉金桥公司(克隆号CCH2+DDG9),免疫组化EnVision两步法试剂盒购自美国DAKO公司。尸检时留取新鲜的胎儿肾脏组织,酚/氯仿法提取DNA,应用荧光定量PCR技术进行CMV DNA检测。PCR试剂盒购自中山大学达安基因公司,StepOne Plus定量PCR仪为美国ABI公司产品。CMV DNA阳性是指>500 copies/mL[7]。

2 结果

2.1 临床特征男女性胎儿分别为3、4例,孕龄24周至37+5周。孕母年龄21～30岁,所有孕母均未进行孕前TORCH检查,例6孕母因孕期多次出现阴道流血及异常的胎儿结构筛查,查血示自身免疫性疾病,TORCH检查提示CMV IgG抗体定量>180 U/mL;例1孕母在备孕及孕早期有用药史。除1例为宫内死胎,其余6例均为孕期B超和(或)MRI检查示胎儿严重畸形而终止妊娠(表1)。6例胎儿显示脑发育异常,包括颅后窝囊肿、颅后窝液体增宽、透明隔腔偏小、脑实质囊性变、硬膜下积液、胼胝体发育不良等,其中1例胎儿还显示先天性心脏病、脐膨出及四肢关节发育异常、羊水增多等。

表1 先天性CMV感染胎儿临床影像特征及肾脏CMV DNA检测

2.2 胎儿尸检

2.2.1外观及内脏检查 5例胎儿外观检查无明显异常,2例胎儿显示外观发育畸形(表2)。5例胎儿出现肉眼可辨的脑结构异常,包括胼胝体发育不良、脑室扩张(脑积水)、脑实质囊性变等。其他内脏检查异常包括:膈疝伴肺发育不良、肠道旋转异常、室间隔缺损及小肠肠管扩张等。例6(24周孕龄)体表参数及内脏器官发育符合孕21周,胎儿脑/肝脏重量比值5.86,且多个内部脏器重量小于相应孕周的正常值范围,提示非对称性宫内生长受限。

表2 先天性CMV感染胎儿的尸检特征

2.2.2镜检 7例尸检胎儿器官切片最明显的组织学特征为CMV感染,以肾脏最为显著(表2)。6例胎儿肾脏切片显示CMV包涵体,HE切片表现为肾小管上皮细胞内大而明显的圆形紫红色核内病毒包涵体及嗜碱性颗粒状胞质内包涵体(图1A),伴周围肾间质多少不等的慢性炎症细胞浸润。出现CMV包涵体的组织还包括肝及胆管上皮细胞(图1B)、胰腺腺泡细胞(图1C)、甲状腺滤泡上皮、肺泡上皮、血管内皮细胞及脑组织。代表性切片行免疫组化染色显示CMV抗体阳性(图1D、E)。次常见的组织学改变见于中枢神经系统,5例胎儿脑实质显示不同程度的病理形态学变化,包括脑实质坏死、钙盐沉积,蛛网膜淋巴浆细胞浸润及含铁血黄素沉积(图1F～H),以及缺血缺氧性脑病相关组织学改变(包括神经元凋亡及噬神经现象)等,而CMV包涵体在脑组织中不常见,仅在2例中观察到,见于垂体、脑实质。其他异常组织学改变包括:子宫附件周围肾上腺异位,肺羊水和(或)胎粪吸入,提示胎儿宫内慢性病理应激状态的胸腺组织学异常,表现为胸腺皮髓质分界不清伴胸腺小体明显增多。

例2所有器管组织切片均未见明确CMV包涵体,表现为肾皮质内较多量散在微钙化灶(图1I)及严重的中枢神经系统病理学变化(表2)。

2.2.3CMV DNA检测结果 例1～5进行了肾脏CMV DNA检测,结果均为阳性(表1)。

2.3 胎盘检查7例胎盘均进行了病理学检查(表3)。除例2胎盘组织学改变不明显外, 6例胎盘显示慢性绒毛炎,其中5例胎盘绒毛内见CMV包涵体(图2A)、浆细胞性慢性绒毛炎(图2B);例5胎盘HE切片未见明确CMV包涵体,表现为高级别斑片状慢性绒毛炎,绒毛聚集伴间质单核淋巴细胞、组织细胞聚集,绒毛纤维化及灶性绒毛坏死(图2C)。此外,4例显示绒毛发育成熟延迟,1例胎盘底蜕膜螺旋动脉缺乏生理转化,1例单脐动脉,例4、5胎盘重量异常。

3 讨论

CMV属疱疹病毒β亚科,是已知最大的DNA病毒,其分布广泛,人是唯一的宿主。正常人群感染CMV后,一般无临床症状或症状轻微。随年龄增加,CMV感染率增高,我国育龄女性CMV IgG阳性率>90%[8-9],欧美等发达国家育龄女性CMV IgG阳性率41%～50%[10-11]。约32%原发性CMV感染和1.4%继发性感染的妊娠妇女可垂直传播给胎儿[12-13]。发展中国家女性孕期CMV感染主要为继发性感染,发达国家女性孕期感染包括原发性感染和继发性感染。母体原发性感染及继发性感染均可能导致胎儿先天性感染。先天性CMV感染的主要途径为孕妇感染CMV后,病毒直接感染胎盘滋养细胞和结缔组织细胞,随后到胎儿体内。胎儿的CMV感染率随母体原发性感染时胎龄的增加而升高。

胎儿先天性CMV感染的发病率0.2%～2.2%,常累及多系统、多脏器,导致中枢神经系统畸形、感觉神经性耳聋及死胎等,是胎儿发育过程中出现先天性异常的主要感染因素,新生儿出现后遗症的风险极大[1]。孕早期感染CMV可导致胚胎结构异常,进而流产;而孕晚期感染CMV则会导致神经系统及智力损伤[14]。由于大多数母体感染CMV后无明显临床症状[15],孕前TORCH检查发现母体是否出现CMV感染,以及孕期超声检查评估胎儿状态是必要的。本组中所有孕母均未行孕前TORCH检测,仅1例(例6)孕期检查提示孕母自身免疫性疾病伴发CMV感染,故而不能明确是原发性还是继发性CMV感染;其余6例孕期检查提示胎儿结构异常,其中5例显示脑发育畸形,进而引产终止妊娠。

CMV感染胎儿宫内死亡罕见,亦不是胎死宫内的主要原因。美国一项大型队列研究[16]显示,与感染相关的死产病例中,大肠杆菌、B组链球菌和肠球菌是最常见的细菌病原体,而CMV是最常见的病毒病原体。本组前期研究还显示,严重畸形胎儿的CMV宫内感染率仅为1.6%(7/436),提示人群中胎儿严重畸形与CMV宫内感染无密切关系[8]。本组中仅例6因弥漫性先天性CMV感染导致宫内死胎,该胎儿还出现了胎儿水肿、内眦间距增宽及双足内翻等外观畸形,例4胎儿也显示多发外观和内部脏器发育畸形;但先天性CMV感染的胎儿出现结构畸形不除外与并存的染色体或基因异常相关,需要进一步分析。

CMV可感染几乎所有的器官,由于各器官内病毒复制的程度不同,组织损害程度也不同。CMV在胎儿肾小管上皮定植、复制并排泄至羊水中,因此检测胎儿肾脏CMV DNA最容易发现病毒感染。半数以上甚至全部胎儿尸检病例中可发现CMV感染肾脏,典型特征为肾小管上皮内出现特征性病毒包涵体[17]。肾脏疾病患者肾组织中CMV蛋白可阳性[18],但CMV感染累及胎儿肾脏不会导致肾发育畸形或肾功能异常[19]。本组前期研究中检测例1～5胎儿肾脏的CMV DNA呈阳性[7-8],本组7例尸检胎儿中6例肾脏肾小管上皮见CMV包涵体,周围肾间质显示程度不等的慢性炎症细胞浸润,与以往文献报道相符。例2未见明确病毒包涵体,表现为双侧肾皮质内散在较多量微钙化灶。结合CMV DNA拷贝数检测结果,提示病毒DNA拷贝数低时肾脏可能不表现出典型CMV感染的病理学特征,仅表现为肾实质微钙化灶。

先天性CMV感染是中枢神经损伤的主要原因,常导致胎儿结构畸形。除超声检查外,MRI检查可在部分神经超声阴性的胎儿中检测到额外的异常信号[20]。CMV可能导致发育中大脑的微血管结构破坏、血脑屏障受损、神经突触发生改变、神经干细胞前体细胞丢失,以及细胞迁移异常引起的神经细胞定位紊乱等。病理变化包括:小脑和大脑皮质发育不全、小头畸形、脑膜/脊髓炎、神经元异位、脑室扩大、结节状钙化、出血性病变及含铁血黄素沉积、脑组织坏死等[21-22]。引起的后遗症包括感觉神经性听力减退、智力低下、发育迟缓、脑瘫、癫痫等[23-24]。本组有1例因脑组织明显自溶无法评估,5例显示脑影像学及肉眼可辨的大体异常,主要为脑室扩张或增宽,其他包括胼胝体发育不良、蛛网膜囊肿、脑实质囊性变等。本实验3例出现明显的脑组织学异常,包括脑实质坏死、钙化、出血及多量炎症细胞浸润等,噬神经现象亦较常见。HE切片中,脑组织中CMV包涵体较难识别,进行CMV免疫组化检测可突出显示受感染的细胞。

先天性CMV感染传播的主要途径为胎盘垂直传播[25]。CMV感染胎盘的组织学改变包括:淋巴浆细胞性慢性绒毛炎或坏死性绒毛炎、绒毛纤维化/无血管绒毛、绒毛钙化、绒毛周围纤维蛋白沉积过多、绒毛发育成熟延迟等,典型CMV包涵体在部分胎盘可见[26-28]。胎盘绒毛的组织学改变损害胎盘的母胎物质交换,可能导致胎儿宫内生长受限,最终导致死胎。本组7例胎盘中,除1例组织学改变不明显外,6例显示慢性绒毛炎,其中5例绒毛中见浆细胞浸润,并见或多或少的CMV包涵体。此外,绒毛发育成熟延迟、绒毛周围纤维蛋白沉积增多、绒毛纤维化及钙化也较常见。其他胎盘异常特征包括:单脐动脉、底蜕膜螺旋动脉缺乏生理转化;1例胎盘重量大于相应孕周的第97百分位数,1例胎盘重量小于相应孕周的第5百分位数。

本组中例2虽然胎儿肾脏CMV DNA拷贝数最低,但出现了显著的脑发育异常,胎盘检查表现轻微,HE切片均未观察到明确病毒包涵体。查阅病案资料显示,该孕母2年后妊娠并发肝功能损害,孕39周时因胎儿发育异常引产,胎儿尸检显示类似的双肾肾小球钙盐沉积,并出现胼胝体发育不良、双侧侧脑室明显扩张及轻度缺血缺氧性脑病等异常,未观察到CMV包涵体,未进行CMV DNA检测。2次妊娠之间,该孕母还出现过一次早孕自然流产史。分析原因可能包括:(1)胎儿脑发育异常可能与CMV感染无直接相关性,需进一步行病原学检测及遗传学分析;(2)病毒拷贝数低,HE切片观察CMV包涵体敏感性低,需辅助免疫组化染色,甚至CMV DNA检测[11];(3)两次妊娠胎儿尸检结果类似,推测该孕母两次妊娠均可能为继发性CMV感染,提示继发性先天性CMV感染可能导致严重的脑损伤[29]。目前,尚未见与该病例类似的报道。

CMV感染防治方面,疫苗无明显预防效果,抗病毒治疗取得一定进展[11],但经验有限,需积累更多样本进一步分析。

总之,先天性CMV感染胎儿的影像学主要表现为脑发育异常,脑组织可出现明显的病理学变化,提示幸存胎儿出现严重的后遗症。特征性CMV包涵体最常见于肾脏,其次为胎盘、肝脏、胰腺、甲状腺、肺、脑等组织。CMV感染胎盘的主要组织学变化为浆细胞性慢性绒毛炎及CMV包涵体,其次为绒毛发育成熟延迟、绒毛周围纤维蛋白沉积增多、绒毛钙化及纤维化等;免疫组化检测CMV抗体可增加病毒感染细胞的发现率,出现类似病理特征时应进行染色以查找病因;需进行孕期影像学检查及病毒监测。