单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索

高擎 吴志远 李海洋 李拥军

摘要：目的 探索單细胞转录组测序（scRNA-seq）在多发性大动脉炎（TA）肾动脉病变中的初步应用。方法 纳入2例北京医院血管外科进行肾动脉手术搭桥治疗的TA患者，将其肾动脉组织样本分别采用GEXSCOPE试剂盒和自配消化液2种酶解方式，并进行scRNA-seq和生物信息学分析。结果 共获取2920个细胞纳入下游分析。经过无偏聚类分析后，确定2种内皮细胞、2种平滑肌细胞、1种成纤维细胞、2种单核巨噬细胞、1种T细胞及1种未定义的细胞。其中，2种平滑肌细胞主要表现为收缩型及分泌型。scRNA-seq分析结果显示试剂盒酶解法获取的细胞以内皮细胞（57.46%）为主，免疫细胞（13.21%）较少，而自配消化液酶解法获取的细胞以免疫细胞（34.64%）为主。结论 scRNA-seq可用于区分TA患者病变血管的细胞异质性，不同酶解方式会影响获取细胞的种类与数量。

关键词：大动脉炎；单细胞测序；细胞异质性；内皮细胞；平滑肌细胞

中图分类号： R654.3  文献标志码： A  文章编号：1000-503X（2023）01-0080-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15006

Preliminary Results of Single-cell Transcriptome Sequencing in Renal Arterial Lesions of Takayasu Arteritis

GAO Qing1，WU Zhiyuan2，LI Haiyang，LI Yongjun2

1Department of Cardiovascular Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China

2Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital，Beijing 100730，China

Corresponding author：LI Yongjun Tel：010-85132266，E-mail：liyongjun4679@bjmoh.cn

ABSTRACT：Objective To explore the preliminary application of single-cell RNA sequencing （scRNA-seq） in the renal arterial lesions in Takayasu arteritis （TA） patients.Methods This study included 2 TA patients with renal artery stenosis treated by bypass surgery in the Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital.The obtained 2 renal artery samples were digested with two different protocols （GEXSCOPE kit and self-made digestion liquid） before scRNA-seq and bioinformatics analysis.Results A total of 2920 cells were obtained for further analysis.After unbiased cluster analysis，2 endothelial cell subsets，2 smooth muscle cell subsets，1 fibroblast subset，2 mononuclear macrophage subsets，1 T cell subset，and 1 undefined cell subset were identified.Among them，the two subsets of smooth muscle cells were contractile and secretory，respectively.The results of scRNA-seq indicated that enzymatic hydrolysis with GEXSCOPE kit produced a large number of endothelial cells （57.46%） and a small number of immune cells （13.21%）.However，immune cells （34.64%） were dominant in the cells obtained by enzymatic hydrolysis with self-made digestive liquid.Conclusion scRNA-seq can be employed to explore the cellular heterogeneity of diseased vessels in TA patients.Different enzymatic digestion protocols may impact the proportion of different cells.

Key words：Takayasu arteritis；single-cell RNA sequencing；cellular heterogeneity；endothelial cell；smooth muscle cell

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：80-87

多发性大动脉炎（Takayasu arteritis，TA）是一种流行于东亚的具有高度特异性的自身免疫性血管炎性疾病，主要累及主动脉及其一级分支［1］。TA患者早期几乎无特定的症状或体征，通常以全身性症状为主，常需借助影像学检查发现或诊断，中晚期病变可引起血管狭窄造成严重的器官缺血甚至坏死，导致脑梗死或心肌梗死等［2］。前期大量研究发现TA是一种涉及CD4+ T细胞、树突样细胞（dendritic cell，DC）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）信号通路和巨噬细胞浸润的自身免疫病［3-5］。未知抗原通过DC表面特异性受体激活这一类抗原提呈细胞［6］，分泌多种炎症因子，促进CD4+ T细胞分化为Th17细胞，诱导IL-17、IL-21、IL-22的产生参与下游的细胞毒性反应［7］。然而，由于该病具体发病机制不明，目前多采用免疫抑制剂或生物制剂等药物治疗。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术作为一种新的功能强大的高通量测序技术，可通过分析其捕获的单个细胞的转录组，获取更加详细的细胞信息，进而对比不同状态下细胞的异质性［8］。scRNA-seq技术在颈动脉斑块［9］、腹主动脉瘤［10］等血管外科疾病中已经得到广泛应用。本团队前期采用scRNA-seq技术初步探索了TA患者与健康人群外周血炎症细胞的占比差异，结果发现TA患者CD14+单核细胞比例显著增加［11］。但是目前关于scRNA-seq技术应用于TA血管壁组织的研究报道较少，不同酶解方式获取的细胞种类亦有不同。因此，本研究旨在探索scRNA-seq在TA腎动脉病变中的初步应用，同时为TA的后期多样本单细胞研究提供实验基础。

对象和方法

对象 2019年10月至2020年2月北京医院血管外科收治的2例女性TA患者。患者的体征、血清学及影像学检查结果均符合1990年美国风湿病协会关于TA的诊断标准［12］。本研究通过北京医院伦理委员会批准（伦理审批编号：2018BJYYEC-030001），2例患者均签署知情同意书。

酶解方法 采用2种不同的酶解方法处理TA患者的肾动脉样本，其中，TAKA-R1样本采用GEXSCOPE试剂盒（Singleron Biotechnologies公司，中国香港）酶解法，TAKA-R2采用本中心配制的纤维蛋白酶+透明质酸酶+DNA酶的复合消化液（自配消化液）酶解法，相关酶配制方案正在申请专利中。

scRNA-seq技术 将单细胞悬液加载到微流控芯片上，使用GEXSCOPE单细胞RNA文库试剂盒（Singleron Biotechnologies公司，中国香港）根据Singleron GEXSCOPE操作说明书构建scRNA-seq文库。将文库稀释至4 nmol/L，使用Illumina Novaseq 6000测序平台进行测序，测序模式为150 bp双端测序。

数据质量控制、处理和分析 采用R studio（Version 1.4.1717）中的Seurat进行单细胞表达矩阵的质量控制、前期处理和数据分析。每个Seurat对象都是用在3个以上细胞中表达的基因创建的。其他质量控制条件设置为：（1）每个细胞内所包含的mRNA种类应在200至3000之间；（2）每个细胞内所包含的粒体基因占全部mRNA的比值应小于25%。经过质量控制后，最终获取2920个细胞。使用CellCycleScoring函数计算细胞周期阶段评分。采用SCTransform来减少潜在的批次效应或技术变化。主成分分析设置在1∶20，然后进行无监督的细胞聚类。利用FindAllMarkers及其默认参数用于获取每个簇中特定的差异表达基因，然后选择代表性标记（具有高avg_logFC和调整P<0.05的基因）进行簇标记。内皮细胞与血管平滑肌细胞各自不同亚群之间的差异表达基因采用FindMarkers进行判定，并将调整P<0.05的基因用于京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路分析。

结  果

一般情况 共纳入2例行肾动脉重建术的TA患者。2例患者均接受过药物治疗，但病情仍未控制，影像学检查提示肾动脉严重狭窄，故行肾动脉搭桥手术，并留取肾动脉样本。

TA肾动脉组织的scRNA-seq及无偏聚类分析 TA肾动脉组织样本经scRNA-seq测序后，共有2920个细胞用于下游数据分析，其中1476个细胞来源于TAKA-R1样本，1444个细胞来源于TAKA-R2样本。无偏聚类分析共获取2种内皮细胞（endothelial cell，EC）、2种血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、1种成纤维细胞、2种单核巨噬细胞、1种T细胞及1种未定义的细胞（图1A）。2个样本的分布范围基本相同，但不同区域的分布密度不同（图1B）。EC的代表性基因为ACKR1、VWF、PECAM1等（图1C）。

TA肾动脉组织的EC与VSMC的细胞异质性 根据不同基因在各细胞亚群的表达情况绘制点图，包括EC-1（ADAMTS1、CSF3、STC1）、EC-2（RAMP2、IFI27、FABP4）、VSMC-1（C11orf96、SORBS2、MYL9）、VSMC-2（MYH10、FN1、POSTN）、成纤维细胞（CFD、FBLN1、DCN）、单核巨噬细胞1（S100A9、S100A12、LYZ），单核巨噬细胞2（HLA-DPA1、C1QC、C1QB），T细胞（CCL5、IL7R、CD69），未定义的细胞（TAOK1、LINC01681、SPATA22）（图2）。EC分为2种细胞亚群，其中，EC-1（n=64）主要高表达ACKR1、ADAMTS4、ICAM1、VWF、IL6基因，EC-2（n=75）主要高表达CD36、FABP4、ICAM2、CLDN5、TIMP3基因（图3）；KEGG通路分析显示，EC-1细胞主要参与IL-17、肿瘤坏死因子、核因子κB等信号通路，而EC-2细胞则主要分泌细胞黏附分子等（图4）。VSMC分为2种细胞亚群，其中，VSMC-1（n=24）呈现经典的收缩型，VSMC-2（n=86）则表达更多与纤连蛋白和胶原相关的基因如FN1、COL1A1、COL3A1等（图5），且表达的一些基因参与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、晚期糖基化终末产物（受体）等信号通路（图6）。

不同酶解方式对细胞类型的影响 GEXSCOPE试剂盒酶解方式获取的细胞以EC（57.4%）为主，其次为VSMC（16.5%）和免疫细胞（单核巨噬细胞和T细胞）（13.3%）。自配消化液酶解方式获取的细胞则以免疫细胞（单核巨噬细胞和T细胞）（34.6%）为主，其次为成纤维细胞（29.7%）和EC（27.1%）（表1）。

讨  论

TA作为一种自身免疫性疾病，其发病机制并不明确。目前TA的临床治疗主要是以药物治疗为主，但仍有近20%的患者病情会进展并需采用外科干预［13-14］，以改善器官缺血或者肾血管性高血压。在药物治疗方面，主要以激素和免疫抑制剂为主，尚无特异性针对TA的药物［15］。尽管前期已有部分研究采用一些生物制剂治疗TA［16-17］，但效果并不十分满意。因此，对TA发病机制进行深入探究并为临床药物开发提供一定的依据仍是现阶段的研究重点。

本团队前期采用scRNA-seq技术对TA患者外周血进行分析发现，CD14+单核巨噬细胞的占比较正常人明显升高［11］，同时与氧化应激密切相关的TXNIP、RAGE等基因通路的表达也有所升高，提示单核巨噬细胞所参与的氧化应激反应可能与TA发病相关。在TA患者动脉组织研究方面，Hadjadj等［18］发现TA患者的血清抗体可以通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路刺激血管EC增殖。Dos等［19］发现在TA患者病变血管壁中，巨噬细胞的数量远高于B細胞、T细胞及NK细胞。Chen等［20］在IL-6的诱导实验中证实，TA患者的成纤维细胞在IL-6的作用下可以激活Janus激酶通路，促进纤维蛋白的合成。

scRNA-seq作为一种新型转录组测序方法，可用以分析TA患者血管壁的细胞异质性，并发现各种细胞类型潜在的功能与作用［8］，为探索TA发病机制提供有利的线索。目前，scRNA-seq技术应用于TA动脉组织的研究报道较少。本研究尝试采用两种酶解方法探索EC与VSMC的细胞异质性。有研究表明EC参与了TA的进展，如EC增殖及自身抗原等。Inder等［21］通过病理染色发现TA患者病变血管上EC发生增殖。Mutoh等［22］在TA患者EC细胞膜表面发现了内皮蛋白C受体和B类 Ⅰ 型清道夫受体2种自身抗原，并在患者血清中发现可以结合这2种抗原的自身抗体，此外，进一步研究结果显示抗原抗体结合可促进T细胞的分化。本研究中EC-1表达大量的炎症因子（IL-6，ICAM1），同时高表达IL-17，肿瘤坏死因子，晚期糖基化终产物及其受体信号通路；EC-2高表达ICAM2，TIMP3和白细胞跨膜通路，提示EC在TA疾病进展中可能发挥着关键作用。

VSMC的表型转换过程在血管疾病中发挥着重要作用［23］，已有病例报告提出VSMC的凋亡可能参与TA的进展［24］，也有研究显示VSMC增殖也促进TA炎症反应［25］，但相关机制未明。本研究中发现2种VSMC细胞亚群，其中VSMC-1为经典的收缩型VSMC，主要高表达ACTA2、MYH11基因等；而VSMC-2则高表达FN1、COL3A1、COL1A1基因等，主要编码纤连蛋白和胶原相关的成分。尽管本研究中获取的VSMC数量较少，但VSMC异质性的结果仍提示在TA进展过程中VSMC-2也许发挥着更重要的作用，但尚需进一步的实验验证。

酶解消化是单细胞测序技术的首要操作步骤，但是由于血管壁结构细胞及免疫细胞对不同酶的反应性与耐受性不同，因此，根据不同的研究目的，需要将消化酶的种类、浓度及消化时间等因素进行综合考虑，选择适合的酶解方案，以获得理想的消化效果。近期一项在人腹主动脉瘤的scRNA-seq研究中，美国密歇根大学Gallagher教授团队针对腹主动脉瘤血管壁的酶解方案结果可获取较多的免疫细胞，而结构细胞如EC、VSMC等较少［26］。本研究中采用的2种酶解方法初步结果显示，TAKA-R1样本（GEXSCOPE试剂盒酶解法）中以结构细胞（包括EC和VSMC）为主，免疫细胞占比较低，而TAKA-R2样本（自配消化液酶解法）中免疫细胞占比明显升高，说明GEXSCOPE试剂盒酶解法更适合结构细胞的功能研究，而自配消化液酶解法更适合免疫细胞的功能研究。

本研究存在以下局限性：（1）样本数量少，可能出现个体样本差异性误差；（2）样本体积小，由于手术术式的限制，所获取的样本体积较小。

综上，本研究结果表明，scRNA-seq揭示了TA患者肾动脉组织的细胞异质性，EC及VSMC在TA疾病发展过程中可能发挥了重要作用。同时，不同酶解方式可能会造成最后获取细胞的种类与数量的不同，因此需结合研究目的，选择适宜的酶解方案。

参 考 文 献

［1］陈作观，刁永鹏，刘静思，等.大动脉炎外科分型研究进展［J］.中华医学杂志，2016，96（28）：2277-2280.DOI：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.28.019.

［2］Keser G，Aksu K，Direskeneli H.Takayasu arteritis：an update［J］.Turk J Med Sci，2018，48（4）：681-697.DOI：10.3906/sag-1804-136.

［3］Arnaud L，Haroche J，Mathian A，et al.Pathogenesis of Takayasus arteritis：a 2011 update［J］.Autoimmun Rev，2011，11（1）：61-67.DOI：10.1016/j.autrev.2011.08.001.

［4］Zaldivar Villon MLF，de la Rocha JAL，Espinoza LR.Takayasu arteritis：recent developments［J］.Curr Rheumatol Rep，2019，21（9）：45.DOI：10.1007/s11926-019-0848-3.

［5］Watanabe R，Berry GJ，Liang DH，et al.Pathogenesis of giant cell arteritis and Takayasu arteritis-similarities and differences［J］.Curr Rheumatol Rep，2020，22（10）：68.DOI：10.1007/s11926-020-00948-x.

［6］Seko Y，Sugishita K，Sato O，et al.Expression of costimulatory molecules （4-1BBL and Fas） and major histocompatibility class I chain-related A （MICA） in aortic tissue with Takayasus arteritis［J］.J Vasc Res，2004，41（1）：84-90.DOI：10.1159/000076437.

［7］Kong X，Sun Y，Ma L，et al.The critical role of IL-6 in the pathogenesis of Takayasu arteritis［J］.Clin Exp Rheumatol，2016，34（3 Suppl 97）：S21-S27.

［8］Papalexi E，Satija R.Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity［J］.Nat Rev Immunol，2018，18（1）：35-45.DOI：10.1038/nri.2017.76.

［9］Williams JW，Winkels H，Durant CP，et al.Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research［J］.Circ Res，2020，126（9）：1112-1126.DOI：10.1161/CIRCRESAHA.119.315940.

［10］Yang H，Zhou T，Stranz A，et al.Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of vascular cells in early stage murine abdominal aortic aneurysm-brief report［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2021，41（3）：1158-1166.DOI：10.1161/ATVBAHA.120.315607.

［11］Qing G，Zhiyuan W，Jinge Y，et al.Single-cell RNA sequencing revealed CD14（+）monocytes increased in patients with Takayasus arteritis requiring surgical management［J］.Front Cell Dev Biol，2021，9：761300.DOI：10.3389/fcell.2021.761300.

［12］Arend WP，Michel BA，Bloch DA，et al.The American College of Rheumatology 1990 criteria for the classification of Takayasu arteritis［J］.Arthritis Rheum，1990，33（8）：1129-1134.DOI：10.1002/art.1780330811.

［13］刁永鵬，陈跃鑫，闫盛，等.大动脉炎116例外科手术及腔内治疗效果及安全性分析［J］.中华医学杂志，2016，96（6）：447-450.DOI：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.06.008.

［14］Diao Y，Yan S，Premaratne S，et al.Surgery and endovascular management in patients with Takayasus arteritis：a ten-year retrospective study［J］.Ann Vasc Surg，2020，63：34-44.DOI：10.1016/j.avsg.2019.07.009.

［15］中华医学会风湿病学分会.大动脉炎诊断及治疗指南［J］.中华风湿病学杂志，2011，15（2）：119-120.DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-7480.2011.02.013.

［16］Nakaoka Y，Yamashita K，Yamakido S.Comment on：long-term efficacy and safety of tocilizumab in refractory Takayasu arteritis：final results of the randomized controlled phase 3 TAKT study：reply［J］.Rheumatology （Oxford），2020，59（9）： e48-e49.DOI：10.1093/rheumatology/keaa255.

［17］Tomelleri A，Campochiaro C，Sartorelli S，et al.Effectiveness and safety of infliximab dose escalation in patients with refractory Takayasu arteritis：a real-life experience from a monocentric cohort［J］.Mod Rheumatol，2022，32（2）：406-412.DOI：10.1093/mr/roab012.

［18］Hadjadj J，Canaud G，Mirault T，et al.mTOR pathway is activated in endothelial cells from patients with Takayasu arteritis and is modulated by serum immunoglobulin G［J］.Rheumatology （Oxford），2018，57（6）：1011-1020.DOI：10.1093/rheumatology/key017.

［19］Dos SJ，Artigiani NR，Mangueira C，et al.Associations between clinical features and therapy with macrophage subpopulations and T cells in inflammatory lesions in the aorta from patients with Takayasu arteritis［J］.Clin Exp Immunol，2020，202（3）：384-393.DOI：10.1111/cei.13489.

［20］Chen R，Sun Y，Cui X，et al.Autophagy promotes aortic adventitial fibrosis via the IL-6/Jak1 signaling pathway in Takayasus arteritis［J］.J Autoimmun，2019，99：39-47.DOI：10.1016/j.jaut.2019.01.010.

［21］Inder SJ，Bobryshev YV，Cherian SM，et al.Accumulation of lymphocytes，dendritic cells，and granulocytes in the aortic wall affected by Takayasus disease［J］.Angiology，2000，51（7）：565-579.DOI：10.1177/000331970005100705.

［22］Mutoh T，Shirai T，Ishii T，et al.Identification of two major autoantigens negatively regulating endothelial activation in Takayasu arteritis［J］.Nat Commun，2020，11（1）：1253.DOI：10.1038/s41467-020-15088-0.

［23］Wu ZY，Trenner M，Boon RA，et al.Long noncoding RNAs in key cellular processes involved in aortic aneurysms［J］.Atherosclerosis，2020，292：112-118.DOI：10.1016/j.atherosclerosis.2019.11.013.

［24］Bertipaglia B，Faggin E，Cillo U，et al.Is apoptosis of vascular smooth muscle cells involved in the development of Takayasu arteritis？ Suggestions from a case report［J］.Rheumatology （Oxford），2005，44（4）：484-487.DOI：10.1093/rheumatology/keh515.

［25］Maciejewski-Duval A，Comarmond C，Leroyer A，et al.mTOR pathway activation in large vessel vasculitis［J］.J Autoimmun，2018，94：99-109.DOI：10.1016/j.jaut.2018.07.013.

［26］Davis FM，Tsoi LC，Melvin WJ，et al.Inhibition of macrophage histone demethylase JMJD3 protects against abdominal aortic aneurysms［J］.J Exp Med，2021，218（6）：e20201839.DOI：10.1084/jem.20201839.

（收稿日期：2022-03-23）