马钱子苷抑制CXCL12/CXCR4信号通路对腰椎间盘突出症大鼠疼痛反应的影响

乔松，胡艳平，何生华

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是腰痛和神经放射性腿疼的常见原因，具有病程长、易复发的特点，严重影响患者生活质量［1］。LDH 主要是由于腰神经根受到机械性压迫或髓核局部炎症引起，炎性介质可引起胶质细胞激活及炎性因子、趋化因子的释放，导致神经病理性疼痛的产生［2］。CXC 趋化因子配体12（CXC chemokine ligand 12，CXCL12）又称基质细胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1），主要来源于活化的神经胶质细胞，可与其特异性受体CXC 趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）结合并激活下游通路，参与神经系统功能的调节［3］。研究显示，CXCL12/CXCR4通路参与脊神经结扎诱导的神经性疼痛，使用CXCL12 中和抗体或CXCR4 拮抗剂AMD3100可抑制神经性疼痛的发生，减少脊髓背角中星形胶质细胞标志物——胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和小胶质细胞标志物——离子钙结合衔接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）的表达［4］。马钱子苷（loganin）是从中药山茱萸中提取的环烯醚萜苷类化合物，具有抗炎、抗氧化和保护神经元的作用［5］。研究显示，马钱子苷可抑制氧化应激和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，改善糖尿病神经病变介导的疼痛，从而改善神经性疼痛［6］。本研究基于CXCL12/CXCR4 信号通路，探讨马钱子苷治疗神经性疼痛的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。6～8 周龄SPF 级SD 雄性大鼠50只，体质量210～230 g，购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（豫）2022-0001，动物饲养于温度25 ℃，相对湿度55%的环境中，12 h 昼、夜循环照明，保持环境通风整洁，大鼠正常饮食水。（2）主要试剂与仪器。马钱子苷（纯度：98%）购自Sigma公司；CXCL12及CXCR4拮抗剂AMD3100购自MedChemExpress 公司；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；CXCL12、CXCR4、NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、IL-1β、Iba-1 及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的IgG 二抗购自Abcam 公司。BME-403 Von Frey 纤维丝测痛仪、BME-410C 全自动热痛刺激仪（中国医学科学院生物医学工程研究所）；iMark680 多功能酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；BX53 荧光显微镜（日本Olympus 公司）；ST8R 高速离心机（美国Thermo Scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 实验动物分组及模型制备 大鼠适应性饲养1周后，将50 只大鼠按随机数字表法抽取10 只为假手术组（Sham组），其余40 只大鼠制备LDH 模型［7］，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，于背部正中切开约4 cm 皮下组织，暴露双侧L4—L5椎板并切除半椎板，暴露L5神经根，从尾椎间盘取出约10 mg 髓核置于L5 神经根上，避免压迫，术后每日于臀大肌注射40万U青霉素预防感染，连续给药3 d。Sham组大鼠切开皮肤后仅暴露L4—L5椎板。

造模成功后，将40 大鼠随机分为Model 组、CXCR4 拮抗剂组（AMD3100 组）、马钱子苷组、马钱子苷+CXCL12 组，每组10 只。AMD3100 组给予大鼠鞘内注射20 μg 的AMD3100，马钱子苷组给予大鼠5 mg/kg 的马钱子苷腹腔注射，马钱子苷+CXCL12 组同时给予大鼠腹腔注射5 mg/kg 的马钱子苷及鞘内注射250 ng 的CXCL12，给药剂量参照文献［5，8］，Sham 组与Model 组大鼠同时腹腔注射及鞘内注射等量的生理盐水，每天1次，连续给药2周。

1.2.2 大鼠热撤足反应潜伏期检测 分别于造模后1 d及治疗后3、7、14 d，采用红外辐射测温法评估大鼠热撤足反应潜伏期，将大鼠置于玻璃笼中1 h以适应环境，玻璃表面温度保持在30 ℃，在右后爪下方放置辐射热源，使用足底镇痛仪测定30 s内的热撤足反应潜伏期，测量3次，取平均值。

1.2.3 机械性撤足阈值检测 分别于造模后1 d 及治疗后3、7、14 d，使用BME-410C 全自动热痛刺激仪检测机械性撤足阈值，以von Frey 纤维丝（2.5～50 g）刺激大鼠右肢足底二、三跖骨处，每次刺激测试间隔5 min，连测3次，取平均值。

1.2.4 脊髓背角组织形态学观察 麻醉处死大鼠，取L4—L6节段脊髓背角组织，每组随机抽取5 只大鼠脊髓背角组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片（4 μm），HE染色，显微镜下观察脊髓背角组织形态学变化。剩余大鼠脊髓背角组织置于液氮中保存。

1.2.5 ELISA 法检测脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 取50 mg 脊髓背角组织，按照质量体积比1∶9 的比例加入生理盐水，匀浆后，以离心半径10 cm，5 000 r/min 离心20 min，留取上清液于-20 ℃保存，参照试剂盒说明书检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.6 免疫荧光染色检测脊髓背角组织小胶质细胞的激活情况 取液氮中保存的脊髓背角组织，切成10 μm 的切片，室温干燥后，使用丙酮在4 ℃条件下固定10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，加入1.2%过氧化氢孵育30 min，再使用0.3% Triton X-100 透化30 min，加入Iba-1 抗体（1∶100 稀释），4 ℃孵育过夜，再加入FITC标记的IgG二抗（1∶100）室温孵育1 h，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Western blot 检测脊髓背角组织蛋白表达 取冻存的脊髓背角组织，研磨后加入RIPA裂解液提取组织总蛋白，二辛可宁酸（dicinchonic acid，BCA）法检测蛋白浓度，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转膜；封闭后加入CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin抗体稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗涤后，加入二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。采用Image-Quant 软件分析CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白相对表达量，以βactin为内参。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠热撤足反应潜伏期、机械性撤足阈值比较 建模后1 d，与Sham组比较，其余组大鼠热撤足反应潜伏期、机械性撤足阈值降低（P＜0.05）。在治疗后3 d、7 d 及14 d，与Sham 组比较，Model 组大鼠热撤足反应潜伏期、机械性撤足阈值降低（P＜0.05），与Model 组比较，AMD3100 组与马钱子苷组大鼠热撤足反应潜伏期、机械性撤足阈值升高（P＜0.05）；在治疗后7 d 及14 d，与马钱子苷组比较，马钱子苷+CXCL12 组大鼠热撤足反应潜伏期、机械性撤足阈值降低（P＜0.05），见表1、2。

Tab.1 Comparison of incubation period of hot withdrawal reaction between the five groups of rats表1 各组大鼠热撤足反应潜伏期比较 （n=10，s，）

＊＊P＜0.01；a与Sham 组比较，b与Model 组比较，c与马钱子苷组比较，P＜0.05；表2—4同。

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Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各组大鼠机械性撤足阈值比较（n=10，g，）

Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各组大鼠机械性撤足阈值比较（n=10，g，）

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2.2 各组大鼠脊髓背角组织形态学变化 Sham 组脊髓背角组织结构完整，细胞形态规则，核仁清晰可见，胞浆内尼氏小体颗粒丰富；Model 组脊髓背角组织损伤严重，炎性细胞浸润，细胞形态不规则，核仁及轮廓不清，胞浆中尼氏小体排列不均匀，胞浆呈空泡样变化；AMD3100组与马钱子苷组脊髓背角组织损伤明显改善，细胞形态尚规则，细胞核边缘与核仁较为清晰，胞浆内尼氏小体分布较为均匀，有少量细胞固缩、坏死；马钱子苷+CXCL12 组脊髓背角组织较马钱子苷组病理损伤加重，炎性细胞增多，细胞形态不规则，细胞核边缘模糊，见图1。

Fig.1 Histomorphologic changes of spinal dorsal horn in five groups(HE staining,×100)图1 各组脊髓背角组织形态学变化（HE染色，×100）

2.3 各组大鼠脊髓背角组织小胶质细胞活化情况比较 与Sham组比较，Model组绿色荧光增加，Iba-1阳性表达增多；与Model组比较，AMD3100组与马钱子苷组Iba-1 阳性表达减少；与马钱子苷组比较，马钱子苷+CXCL12组绿色荧光增多，Iba-1阳性表达增加，见图2。

Fig.2 Activation of microglia in each group(immunofluorescence staining,×400)图2 各组小胶质细胞的活化（免疫荧光染色，×400）

2.4 各组大鼠脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 与Sham 组比较，Model 组大鼠脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；与Model 组比较，AMD3100 组与马钱子苷组脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05）；与马钱子苷组比较，马钱子苷+CXCL12 组脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各组大鼠脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（n=10，ng/L，）

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各组大鼠脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（n=10，ng/L，）

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2.5 各组大鼠脊髓背角组织蛋白表达 与Sham 组比较，Model 组大鼠脊髓背角组织CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表达水平升高（P＜0.05）；与Model 组比较，AMD3100 组与马钱子苷组CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表达水平降低（P＜0.05）；与马钱子苷组比较，马钱子苷+CXCL12 组CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β表达水平升高（P＜0.05），见表4、图3。

Fig.3 Expression levels of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1b in spinal dorsal horn of rats in each group图3 各组大鼠脊髓背角组织CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各组大鼠脊髓背角组织CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达比较（n=5，）

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各组大鼠脊髓背角组织CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达比较（n=5，）

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3 讨论

LDH 多发于中年男性，主要表现为反复腰痛和坐骨神经痛；髓核对神经根的机械压迫是产生疼痛的主要原因，神经根在炎症状态下，可激发机体免疫反应并激活小胶质细胞，促进炎性因子释放，引发疼痛［9］。本研究显示，马钱子苷可改善LDH 大鼠疼痛反应，减轻大鼠脊髓背角组织病理损伤，降低炎性因子水平，提示马钱子苷可抑制炎症反应改善LDH大鼠疼痛反应。

小胶质细胞参与中枢神经系统的免疫反应，活化的小胶质细胞可通过分泌TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促进神经炎症反应，引起痛觉过敏［10］。IL-6、IL-1β 等炎性因子水平变化与疼痛程度密切相关，临床上，LDH 患者经过治疗后血清中TNF-α、IL-1β等因子水平下降，神经痛缓解［11］。在LDH动物模型中，抑制脊髓小胶质细胞活化和神经炎症反应可治疗大鼠神经性疼痛［12］。马钱子苷在心血管系统、炎症性疾病与中枢神经系统疾病中具有广泛的应用［13］。据报道，马钱子苷可通过抑制NF-κB 激活，抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的释放，改善慢性压迫性损伤诱导的神经炎症和疼痛行为［14］；马钱子苷还可抑制Aβ1～42诱导的小胶质细胞激活，抑制炎症反应［15］。本研究结果亦证实，使用马钱子苷干预后，大鼠脊髓背角组织小胶质细胞活化减少，同时脊髓背角组织TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低，提示马钱子苷可抑制小胶质细胞活化，抑制脊髓炎症反应，进而改善LDH大鼠疼痛反应。

CXCL12属于趋化因子家族，除了具有趋化淋巴细胞的作用外，还可调节神经信号传递，CXCL12 与其受体CXCR4在神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞均有表达，CXCL12/CXCR4 通路可激活外周伤害性感觉神经元，引发痛觉敏化，在骨癌疼痛、糖尿病引起的疼痛、部分坐骨神经结扎诱导的神经疼痛中发挥重要作用［16-17］。研究显示，在脊髓损伤小鼠模型中，抑制CXCL12/CXCR4 通路可抑制星形胶质细胞的活化和炎症反应，减轻神经性疼痛［18］。Cheng等［8］研究显示，马钱子苷可通过抑制CXCL12/CXCR4 通路介导的NLRP3 炎性小体的激活来减轻坐骨神经慢性压迫损伤诱导的神经性疼痛。在本研究中，Model 组大鼠脊髓背角组织中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表达水平较Sham组均升高，表明CXCL12/CXCR4信号通路被激活；给予马钱子苷治疗后，大鼠脊髓背角组织中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表达水平均降低，提示马钱子苷对LDH 大鼠疼痛反应的改善作用可能与抑制CXCL12/CXCR4 信号通路激活有关。此外，CXCR4 拮抗剂AMD3100 可改善LDH 大鼠脊髓背角组织病理损伤，马钱子苷与AMD3100的作用结果一致；而在马钱子苷干预的基础上给予模型大鼠鞘内注射CXCL12 后，马钱子苷对模型大鼠疼痛反应的改善作用被明显减弱，提示马钱子苷可能通过抑制CXCL12/CXCR4 信号通路的激活，抑制小胶质细胞活化与炎症反应，改善LDH大鼠疼痛反应。

综上所述，马钱子苷可改善LDH 大鼠疼痛反应，可能与抑制CXCL12/CXCR4信号通路活性有关。本研究从体内水平初步探究了马钱子苷治疗神经性疼痛的分子机制，除CXCL12/CXCR4信号通路外，马钱子苷能否通过其他因子或通路发挥作用仍需进一步探究，在未来的研究中将结合体外细胞实验深入验证马钱子苷的作用机制。