农产品加工副产物的益生活性研究

黄小玲,陈铎,崔春*

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院,广州 510640;2.梅州市飞龙果业有限公司,广东 梅州 514000)

农产品加工过程中会产生大量的副产物,这些副产物除部分被用作动物饲料和土地肥料外,大多数被直接丢弃,造成了严重的资源浪费和环境污染[1]。事实上,有些农副产物富含膳食纤维、黄酮、多酚、精油等生物活性物质[2],将这些活性成分进一步开发应用于食品添加剂或膳食补充剂可以达到副产物的高值化利用,从而实现资源效益最大化[3]。目前大多数研究主要集中于对酚类化合物的提取和利用上,而较少考虑纤维等不溶性成分[4]。膳食纤维是一种天然的碳水化合物聚合物,主要存在于植物细胞壁中,易与酚类物质结合,形成抗氧化膳食纤维[5]。此外,膳食纤维也被称为益生元,可以选择性地刺激结肠中益生菌的活性并促进其增长[6]。因此,富含膳食纤维和酚类化合物的原料作为功能性和益生元成分在创新食品中具有广泛的应用前景。

益生菌被定义为活的微生物,适量摄入后对宿主机体有益[7]。研究证实,乳酸杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属和布拉迪酵母菌对宿主健康有益,其对人体的益生特性也被充分研究,工业上广泛用作开发新型益生元的供试益生菌[8-10]。

本文以水果、谷物和食用菌等加工过程中产生的常见农副产物(橙皮、橙瓤、陈皮渣、菠萝渣、苹果渣、米糠、香菇渣、灵芝渣)为研究对象,对其基本成分和抗氧化活性进行测定和评价,并选取两种益生菌进行体外模拟发酵,通过观察益生菌生长过程中活菌数、pH和短链脂肪酸3个指标来探讨不同来源农副产物作为新型益生元的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

橙皮、橙瓤、菠萝渣、苹果渣:橙子、菠萝和苹果榨汁后的副产物,梅州市飞龙果业有限公司;陈皮渣:广州绿萃生物科技有限公司;香菇渣、灵芝渣:香菇和灵芝经热水提取后的副产物,无限极(中国)有限公司;米糠:中山市聚丰园粮油食品有限公司;Probio-Tec®AB-SastBl-12(嗜酸乳杆菌-双歧杆菌复合菌,简称AB菌):丹麦科汉森股份有限公司;布拉迪酵母菌:善邑食品(上海)有限公司;丙酮、碳酸钠、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝(均为分析纯):广东广试试剂科技有限公司;没食子酸:北京百灵威科技有限公司;芦丁:上海源叶生物科技有限公司;福林酚、氢氧化钠、乙醇、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸(均为分析纯):上海麦克林生化科技有限公司。

MRS活化培养基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母膏4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、七水磷酸氢二钾2.0 g、三水乙酸钠5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、七水硫酸镁0.2 g、四水硫酸锰0.05 g,用无菌水定容至1 L,调pH至6.2±0.2。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD培养基):蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g,用无菌水定容至1 L,调pH至6.0±0.2。

1.2 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计、电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司;LC-100液相色谱仪 上海伍丰科学仪器有限公司;pH计量仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;XW-80A漩涡混合器 上海精科实业有限公司;SW-CJ-1FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品基本成分的检测

参照GB 5009.3-2016测定样品的水分含量;参照GB 5009.6-2016中的索氏抽提法测定样品的脂肪含量;参照GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法测定样品的蛋白质含量;参照GB 5009.88-2014测定样品的可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维含量;参照GB 5009.4-2016测定样品的灰分含量。

1.3.2 多酚含量的测定

采用福林-酚法[11],以没食子酸为标准品,以没食子酸浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度A765 nm为纵坐标绘制标准曲线:Y=62.4X+0.047 3(R2=0.997 9)。

称取0.50 g样品,按料液比1∶10 (质量与体积比)加入80%丙酮,常温下200 W超声提取20 min后进行离心(5 000 r/min,15 min),收集上清液,滤渣按前面步骤重复2次[12],合并上清液。将上清液于50 ℃旋转蒸发。将浓缩物用蒸馏水定容至50 mL棕色容量瓶中,得到多酚提取液,备用。将1 mL提取液与2 mL福林-酚试剂混合后静置3 min,再加入10% Na2CO3溶液2 mL,定容至25 mL,混匀后置于暗处反应90 min,在765 nm波长处测定吸光度,根据标准曲线计算总酚含量,以每克干基(dry weight,DW)样品中含有相当于没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)的毫克数(mg GAE/g DW)表示。

1.3.3 黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠法[13],以芦丁为标准品,以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度A510 nm为纵坐标绘制标准曲线:Y=1.235 9X+0.035 4(R2=0.999 7)。

称取0.20 g样品,按料液比1∶10(质量与体积比)加入70%甲醇,70 ℃水浴浸提20 min,然后进行离心(5 000 r/min,15 min),收集上清液[14]。滤渣按前面步骤重复2次,合并上清液,用70%甲醇定容至10 mL,得到黄酮提取液,备用。移取1 mL提取液于25 mL容量瓶中,另取5%亚硝酸钠溶液0.5 mL和10%硝酸铝溶液1.0 mL,混匀,静置6 min;加4%氢氧化钠溶液4 mL,用70%甲醇定容至25 mL,摇匀,静置15 min。显色稳定后,在510 nm处以70%甲醇管为空白,测定其吸光度,根据标准曲线计算总黄酮含量,以每克干基样品中含有相当于芦丁当量(rutin equivalent,RE)的毫克数(mg RE/g DW)表示。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.4.1 样品乙醇提取液的制备

参考唐明明等[15]的方法,将样品与70%乙醇按照0.25,0.5,1,2,4,8 mg/mL的浓度称取,常温下200 W超声提取30 min后离心(5 000 r/min,15 min),收集上清液,待用。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率的测定

参考张智等[16]的方法,取1 mL不同浓度的样品乙醇提取液于试管中,加入3 mL 0.1 mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液,混匀,室温下避光反应30 min。反应完全后,于517 nm波长处测定溶液的吸光度。空白组为1 mL无水乙醇和3 mL 0.1 mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液。对照组为1 mL不同浓度的样品乙醇提取液和3 mL无水乙醇。半抑制浓度(IC50)是指当清除率达到50%时的样品浓度,用来衡量自由基清除率。

式中:A0为空白组的吸光度值;A1为样品组的吸光度值;A2为对照组的吸光度值。

1.3.4.3 ABTS自由基清除率的测定

参考唐明明等[15]的方法,取一定量的ABTS,用磷酸盐缓冲液(PBS,0.2 mol/L,pH 7.2)溶解配制成7 mmol/L溶液,再加入等体积的2.45 mmol/L过硫酸钾,混匀,室温下避光反应16 h后得到ABTS储备液,使用时将其稀释至吸光度值为0.7±0.02。取0.15 mL样品乙醇提取液于试管中,再加入ABTS稀释液2.85 mL,室温下避光反应10 min后,于734 nm波长处测其吸光值。对照组为0.15 mL乙醇溶液和2.85 mL ABTS稀释液。

式中:A0为样品组的吸光度值;A1为对照组的吸光度值。

1.3.5 益生菌模拟体外发酵

1.3.5.1 菌种的活化

菌种活化参考刘露等[17]的方法。

AB菌活化:在无菌操作条件下,将菌种冻干粉接种于已灭菌的MRS活化培养基中,混匀,37 ℃培养24 h,以10%接种量继续培养传代。传代3次后,取第3代菌液,用生理盐水稀释至菌落数量为107CFU/mL,于4 ℃保存备用。

布拉迪酵母菌活化:用已灭菌的YPD培养基来活化布拉迪酵母菌,其他操作同上。

1.3.5.2 不同样品发酵

参考陈则华等[18]的方法。按质量分数2%分别加入不同样品至不含葡萄糖的MRS、YPD液体培养基中,振荡溶解混匀后进行高温高压灭菌,冷却至室温,待用。在无菌操作条件下,按照5%的接种量分别接种于不同碳源的发酵培养基中,于37 ℃厌氧培养48 h。

1.3.5.3 益生菌菌落总数的测定

参照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定益生菌的菌落总数。

1.3.5.4 发酵液pH值的测定

使用pH计直接测定发酵前后发酵液的pH值。

1.3.5.5 短链脂肪酸含量的测定

采用HPLC定量样品中短链脂肪酸含量[19]。取适量样品发酵液,在5 000 r/min条件下离心10 min,取1 mL上清液用超纯水稀释5倍,经0.25 μm孔径滤膜过滤后进行HPLC测定分析。乳酸的标准曲线为Y=1 806.8X-28.389,R2=0.995 9;乙酸的标准曲线为Y=583.54X-3.624 6,R2=0.998 7;丙酸的标准曲线为Y=1 427.4X-3.993 3,R2=0.997 8;丁酸的标准曲线为Y=1 385.4X-9.534 6,R2=0.997 4;其中Y为峰面积,X为短链脂肪酸的浓度。色谱条件:色谱柱为MARS MOA(300 mm×7.8 mm,10 μm),进样量为10 μL,流动相为2.5 mmol/L H2SO4,等度洗脱,流速为0.6 mL/min,柱温为35 ℃,检测波长为210 nm。

2 结果与分析

2.1 基本营养成分分析

由表1可知,8种农副产物的基本成分含量存在明显差异,但每种副产物的主要成分都是膳食纤维。副产物的膳食纤维以不溶性为主,其中苹果渣中不溶性膳食纤维含量为14.22 g/100 g,而灵芝渣中其含量高达77.66 g/100 g。副产物中可溶性膳食纤维含量远低于不溶性膳食纤维含量,大部分小于10 g/100 g,其中陈皮渣中含量最高,达到13.15 g/100 g。不溶性膳食纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,有助于肠胃蠕动;可溶性膳食纤维主要为果胶、粘胶等,是结肠中微生物发酵的重要碳源[20-21]。除膳食纤维外,副产物中还有少量的蛋白质和脂肪残留。考虑到副产物中膳食纤维含量高,可以用作开发含纤维创新食品的原料,如饮料、乳制品或烘焙产品等。

表1 不同副产物的基本成分

2.2 多酚和黄酮含量

对不同副产物的多酚和黄酮含量进行了测定,结果见图1。

图1 不同副产物的多酚和黄酮含量

由图1中A可知,不同农副产物的多酚含量存在一定的差异,其中橙皮的多酚含量最高,高达11.19 mg GAE/g DW,陈皮渣和橙瓤的多酚含量次之,分别为10.83,8.79 mg GAE/g DW,灵芝渣的多酚含量最低,仅为0.71 mg GAE/g DW。多酚是一种重要的生物活性物质,广泛存在于植物源食品中,具有良好的抗氧化、抗肿瘤、缓解抑郁、降低胆固醇水平和预防心脑血管疾病等生理功效[22]。有研究表明,多酚化合物是潜在的益生元候选者,因为它们是不可消化的可发酵营养素,有助于促进有益于肠道健康的细菌(益生菌)的生长并增强其活性[23]。由此推测,橙皮和陈皮渣的多酚含量较高,有可能作为新型的益生元。

由图1中B可知,不同副产物的黄酮含量与多酚含量的分布类似,其中陈皮渣的黄酮含量最高,为15.90 mg RE/g DW,橙皮和橙瓤的黄酮含量次之,分别为12.57,10.30 mg RE/g DW,灵芝渣的黄酮含量最低,仅为2.90 mg RE/g DW。黄酮类化合物大多存在于蔬菜、水果中,对于人体健康具有促进作用。黄酮类化合物通过促进益生菌的生长代谢(产生短链脂肪酸)、抑制病原菌的增殖、维持肠道菌群的多样性来发挥生物活性作用[24]。因此,推测黄酮含量高的副产物可能会有较强的抗氧化能力和益生活性。

2.3 抗氧化能力

DPPH和ABTS自由基清除率可以用来衡量样品的抗氧化能力,而且重复性高,常用来评估各种天然化合物的抗氧化能力[25]。测定DPPH和ABTS自由基清除率为50%时不同样品的浓度(IC50),结果见图2。

图2 不同副产物的DPPH和ABTS自由基清除能力

由图2可知,在8种副产物中,陈皮渣对DPPH和ABTS自由基清除率的IC50值分别为2.19,1.35 mg/mL,半抑制浓度(IC50)较低,表明抗氧化活性较强。而香菇渣的半抑制浓度最高,对DPPH和ABTS自由基清除率的IC50值分别为27.92,17.51 mg/mL,表现出较差的抗氧化能力。Gu等[26]对16种水果和蔬菜的抗氧化性能进行了研究,并通过分离和光谱法测定了单个酚酸和类黄酮的含量,发现多酚和黄酮的含量与抗氧化活性之间存在高度相关性,其中酚酸对抗氧化活性的贡献更大,这与本实验测定的结果一致。总的来说,水果副产物(特别是柑橘类)比谷物和食用菌的抗氧化活性强,推测是抗氧化膳食纤维的良好来源。

2.4 益生菌模拟体外发酵

2.4.1 益生菌菌落总数

由图3可知,培养48 h后,相比培养0 h(初始菌落数量均为107CFU/mL),8种不同的副产物均可以提高两种益生菌的活菌数。此外,研究结果显示,不同副产物对同种益生菌的增殖效果不同,且同种副产物对不同益生菌的增殖效果也存在差异。以橙瓤作为发酵底物,AB菌的增殖效果最优,以苹果渣和香菇渣作为发酵底物,AB菌的增殖效果最差,而以橙皮、陈皮渣、菠萝渣、米糠、灵芝渣作为发酵底物,对AB菌的增殖效果无明显差异(P>0.05)(见图3中A)。相同条件下发酵48 h,布拉迪酵母菌的数量增长更多(见图3中B),表明8种副产物对该菌的促增殖能力强于AB菌,其中橙瓤的促增殖效果最好,而菠萝渣和陈皮渣的促增殖能力明显弱于其余副产物(P<0.05)。分析差异产生的原因可能是不同益生菌对不同碳源的需求和代谢能力不相同。整体而言,水果副产物(特别是橙皮、橙瓤)和谷物副产物(米糠)对两种益生菌的促增殖作用较突出,可能是潜在的优质益生元。

图3 体外发酵48 h后的菌落数量

2.4.2 发酵液pH值

由图4可知,两种益生菌发酵前后,所有副产物发酵体系的pH均下降。这是由于副产物作为碳源被益生菌代谢后产生了不同类型的酸性物质(如乙酸等短链脂肪酸),从而降低了发酵液的pH值。对于两种益生菌而言,以橙皮和橙瓤作为发酵底物,体系的pH降低幅度最大(P<0.05),表明益生菌对副产物的利用程度高,代谢产生的有机酸含量多。而由香菇渣、米糠和灵芝渣构成的发酵体系pH变化不明显,表明益生菌对副产物的消化利用率低。

2.4.3 短链脂肪酸含量

不同农副产物经发酵48 h后短链脂肪酸的含量见图5。

图5 不同副产物发酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量

乳酸是益生菌发酵的重要产物,可以反映益生菌的生长情况[27]。由图5中A可知,AB菌发酵48 h后,橙皮和橙瓤发酵产生的乳酸含量较高,分别为5.31,5.81 mg/mL。布拉迪酵母菌发酵48 h后,橙皮发酵产生的乳酸最多,含量达到3.81 mg/mL,其次是橙瓤、米糠和菠萝渣,分别为2.83,2.75,2.68 mg/mL。短链脂肪酸,特别是乙酸、丙酸和丁酸,是肠道微生物发酵膳食纤维的重要代谢产物,对人体健康起着重要的作用[28]。乙酸是多数益生菌代谢的主要产物,能够合成胆固醇,参与人体代谢,为宿主提供能量。由图5中B可知,AB菌发酵48 h后,橙皮发酵产生的乙酸含量较高,为2.19 mg/mL,菠萝渣、香菇渣和橙瓤次之,乙酸含量分别为1.77,1.65,1.43 mg/mL。布拉迪酵母菌发酵48 h后,8种副产物发酵液中的乙酸含量差别不是很大。丙酸可以影响肝脏中胆固醇的代谢,抑制胆固醇的合成,在机体内发挥积极的作用。由图5中C可知,AB菌发酵橙皮产生丙酸的能力最强,发酵液中丙酸含量为1.74 mg/mL,发酵灵芝渣产丙酸的能力最弱,发酵液中丙酸含量仅为0.02 mg/mL。不同副产物均可促进布拉迪酵母菌发酵产生丙酸,且产丙酸的能力差别不大。丁酸是肠道上皮细胞的主要能量来源,这种短链脂肪酸的产量明显少于其他短链脂肪酸,但对于维持机体的健康至关重要。由图5中D可知,AB菌发酵橙瓤、米糠和橙皮产生的丁酸较多,分别为0.14,0.13,0.12 mg/mL,而布拉迪酵母菌发酵橙皮产丁酸的能力强,其余副产物发酵产丁酸的能力无明显差异(P>0.05)。

3 结论

本实验通过对8种农副产物进行比较,结果发现橙皮、橙瓤和陈皮渣等柑橘类水果副产物的酚类物质含量高、抗氧化活性强,是抗氧化膳食纤维的良好来源。此外,本研究进一步采用体外厌氧发酵体系评价不同副产物的益生元特性,结果表明橙皮和橙瓤具有显著的益生作用,表现为促进乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的生成,显著降低pH值,促进嗜酸乳杆菌-双歧杆菌复合菌和布拉迪酵母菌等有益菌增殖。