亚硝酸盐对酸菜中菌属微生物量的影响及相关性分析

魏振勇,李娜,孙全敏,王严,迟乃玉,张庆芳*

(1.大连大学 生命健康学院,辽宁 大连 116622;2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁 大连 116622)

自古民以食为天,酸菜发酵在中国已经有3 000多年的历史,从周朝开始就已经有了相关记载[1]。东北酸菜颜色金黄、味道酸香,含有有机酸和可溶性蛋白等大量的营养物质,具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗癌、免疫调节等多种功能,其发酵菌种主要是乳酸菌,包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、肠膜明串珠菌属(Leuconostocmesenteroides)等[2-3]。亚硝酸盐(NIT)是常见的致癌物质之一,相比于其他食物,在腌制肉制品、泡菜及变质的蔬菜中含量较高[4]。有研究表明,正常成人食用0.2～0.5 g的NIT就可以导致中毒现象,如果超过3 g就会危及生命甚至导致死亡,NIT中毒引起的危害主要包括头痛头晕、恶心、腹痛、口唇皮肤黏膜紫绀,严重的还会引起高铁血红蛋白症、肺水肿、心源性休克等[5-6]。

在发酵过程中酸菜匀浆理化指标及微生物量和种类对酸菜中挥发性成分、风味等尤为重要。Lin等[7]研究发现,Bacteroides、Lactobacillus、Lactococcus、Enterobacter等菌属是产挥发性成分的主要物种。Liang等[8]研究发现植物乳杆菌和戊酸杆菌共接种发酵可提高酸菜中醇类、酯类、醛类、烃类和腈类的浓度。目前学者们专注于发酵体系中菌群结构以及多样性的研究,利用相对丰度值变化来分析菌群的生长状况,但采用相对丰度的分析方法忽略了微生物群落的数量和属水平的样本间差异,造成了分析结果的偏差[9]。Ruben等[10]研究发现,相对丰度的增加不一定与菌群的生长(绝对丰度的增加)有关,在发酵过程中可能会出现相对丰度减少,但绝对丰度不变甚至增大的情况。相关性分析将两个或多个具备相关性的变量元素进行分析,衡量两个变量因素的相关密切程度。迟雪梅等[11]对酸菜中pH、NO2-残留量、亚硝峰值等指标进行相关性分析,研究发现匀浆最低pH值与菜中NIT残留量相关性显著。韩宏娇等[12]研究发现酸菜pH与乳酸菌数、TAN呈极显著负相关。乳酸菌会降解NIT,但NIT对乳酸菌等菌群的影响、酸菜中优势菌属微生物量与理化指标的相关性研究鲜有报道。

本研究以白菜为原料,采用小型独立发酵体系进行发酵,制作多个独立体系,每次取样采用不同的体系,减少杂菌污染的问题,摇匀后取样,避免了传统上在发酵液上、中、下三层取样的方式。测量发酵过程中理化指标及OD600 nm的变化,将不同发酵阶段菌属相对丰度与发酵过程中测定的OD600 nm的乘积作为微生物量,对菌属微生物量与OD600 nm及理化指标进行相关性分析。探究东北酸菜不同发酵阶段NIT对菌属微生物量的影响,分析优势菌属微生物量与OD600 nm及理化指标的相关性,可对未来改善发酵过程、新型发酵菌剂的研发提供参考性意见。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

新鲜大白菜;硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠、酚酞、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、琼脂(均为分析纯):上海麦克林生化科技有限公司;DP812土壤基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司;16S rDNA基因V3～V4区引物合成及建库测序:由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.2 仪器与设备

PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;CRY-2112恒温摇床 上海茸研仪器有限公司;DK-S26电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;Thermo Multiskan 1510酶标仪 芬兰Labsystems公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-1200型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 东北酸菜自然发酵的制作工艺

1.3.1.1 工艺流程

选取新鲜大白菜→预处理(修整、清洗、烫漂、沥水、切分)→装瓶腌制→注盐水→封盖→25 ℃发酵→获得成品。

1.3.1.2 操作要点

采用生渍法腌渍东北酸菜。挑选新鲜的大白菜清理好外层叶片,将白菜顺着菜帮掰成若干片后,用清水清洗干净,沥干表面水分后将白菜切成0.5～1 cm的均匀细丝。注意保证不同部位的白菜细丝混匀,选用统一规格的555 mL PET为材料制备的东北酸菜发酵容器若干瓶,每瓶分装160 g混匀的白菜丝,再注入1.5%的盐水至满瓶,最终形成封闭发酵体系,将全部酸菜放置于25 ℃恒温培养箱中发酵,得到酸菜成品。

1.3.2 取样

将自然发酵酸菜记为S组,添加NIT(亚硝酸钠100 mg/L)为Y组。每瓶酸菜代表不同发酵时间点的独立发酵体系,酸菜匀浆作为研究对象,以1 h为取样起点,每隔12 h取出一瓶发酵菜进行理化指标(pH、TAN、NIT)及OD600 nm的测定,至发酵结束。

1.3.3 酸菜理化指标的测定及计算

将瓶内酸菜与发酵液倒入烧杯中,将其全部研磨后制成匀浆,分别称取10 g酸菜匀浆作为待测样品,进行理化指标的检测[13-14]。pH的测定:使用pH计;TAN含量的测定:参照GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法;NIT含量的测定:参照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法;OD600 nm的测定:采用紫外分光光度计测定在波长600 nm处的吸光度值。菌属的微生物量=所代表菌属的相对丰度×OD600 nm。以上所有实验重复测定3次取平均值。

1.3.4 高通量测序

对S组和Y组的理化指标及OD600 nm进行分析,选取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d 5个时间点的酸菜样本,S组分别标记为 S1、S2、S3、S4、S5;Y组分别标记为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5;每个酸菜样本3个重复。最后将选出的样本进行16S rDNA高通量测序,按照土壤基因组DNA提取试剂盒说明书提取样本DNA,以其为模板,采用引物对338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 酸菜自然发酵体系OD600 nm、理化指标及相关性分析

2.1.1 自然发酵体系OD600 nm及理化指标

自然发酵(S组)过程中不同时间点酸菜样本的OD600 nm及理化指标的变化情况见图1。

图1 S组发酵过程中理化指标及OD600 nm

由图1可知,pH值整体呈下降趋势,在发酵前期乳酸菌含量较少,产酸量低,pH下降缓慢,在13～25 h下降趋势剧烈,然后逐渐平缓。马欢欢等[15]研究表明,pH随发酵时间的延长而下降,最终稳定在3左右,与本研究结果一致。总酸(TAN)、OD600 nm呈上升趋势,Hu等[16]研究发现,发酵过程中TAN增长是由于乳酸菌产生乳酸等酸性物质,发酵时间为25 h时,达到亚硝峰,此时NIT含量为32.63 mg/L,此后NIT含量逐渐降低。

2.1.2 自然发酵体系OD600 nm及理化指标相关性分析

由表1可知,在1～73 h,S组的OD600 nm与TAN表现为正相关,pH与OD600 nm、TAN均表现为负相关,NIT与各理化指标及OD600 nm相关性较弱,其原因可能是前期既有NIT生成,又有NIT降解,进一步分析达到亚硝峰(25 h)后理化指标及OD600 nm相关性。

表1 S组在1～73 h理化指标及OD600 nm相关性分析

由表2可知,在25～73 h,S组的pH与NIT、OD600 nm与TAN均表现为正相关,NIT与OD600 nm、NIT与TAN、pH与TAN均表现为负相关,进一步添加亚硝酸盐验证整个发酵过程中理化指标及OD600 nm相关性。

表2 S组在25～73 h理化指标及OD600 nm相关性分析

2.2 酸菜添加亚硝酸盐体系OD600 nm、理化指标及相关性分析

2.2.1 添加亚硝酸盐体系OD600 nm及理化指标

添加亚硝酸盐(Y组)发酵过程中不同时间点酸菜匀浆样本的OD600 nm及理化指标的变化情况见图2。

图2 Y组发酵过程中理化指标及OD600 nm

由图2可知,NIT影响整个发酵过程中的菌群浓度,使TAN含量整体偏低,其原因可能是一些不耐盐的产酸菌生长受到抑制,导致pH值整体偏高,在13～37 h,NIT含量下降趋势更剧烈。

2.2.2 添加亚硝酸盐体系OD600 nm及理化指标相关性分析

由表3可知,在1～73 h,Y组的OD600 nm与TAN、pH与NIT均表现为正相关,pH与OD600 nm、pH与TAN及NIT与OD600 nm、NIT与TAN均表现为负相关。

表3 Y组在1～73 h理化指标及OD600 nm相关性分析

2.3 酸菜发酵过程中菌属微生物量与OD600 nm及理化指标相关性分析

2.3.1 酸菜发酵过程中菌属微生物量

利用OD600 nm来测量菌群在发酵阶段菌体浓度作为该点样本中微生物的相对总数,并与高通量测得的各菌属的相对丰度相乘得出更准确的各菌属的相对数量,因此各菌属的微生物量(积累量)为所代表菌属的相对丰度与OD600 nm的乘积。选取菌群中相对丰度前九的优势菌属进行微生物量分析(见图3),在S组中,Lactococcus、Leuconostoc在发酵过程中相对丰度变化均呈先上升后下降的趋势,但其微生物量始终保持上升趋势。Lactobacillus的相对丰度在S5阶段是S3阶段的2倍,但其微生物量在S5阶段是S3阶段的7倍。在Y组中,Lactococcus、Leuconostoc的相对丰度在Y3～Y4阶段变化差值分别为2.07%、0.04%,但Lactococcus的微生物量在Y4阶段是Y3阶段的2.46倍,Leuconostoc的微生物量在Y4阶段是Y3阶段的2.38倍;Lactobacillus在各发酵阶段相对丰度、微生物量都微小且无明显变化。因此可知添加NIT对Lactococcus、Leuconostoc的生长有促进作用,但对Lactobacillus的生长有抑制作用。在发酵过程中出现的有害菌属如uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae,其微生物量Y组始终低于S组,说明NIT可以抑制某些有害菌的生长。

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2.3.2 酸菜匀浆中菌属微生物量与OD600 nm及理化指标的相关性分析

选取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d时间点优势菌属微生物量与OD600 nm及理化指标进行相关性分析,结果见表4。

由表4可知,在S组中OD600 nm与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc、Lactobacillus相关性系数分别为rs22=0.884 5,rs24=0.929 3,rs25=0.930 8,rs27=0.896 9,相关性大小顺序是|rs25|>|rs24|>|rs27|>|rs22|;TAN与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为rs32=0.931 1,rs34=0.962 8,rs35=0.964 9,相关性大小顺序是|rs35|>|rs34|>|rs32|;pH与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为rs42=-0.954 7,rs44=-0.962 7,rs45=-0.952 1,相关性大小顺序是|rs44|>|rs42|>|rs45|。各菌属微生物量与NIT相关性较弱,可能是25 h的亚硝峰导致的,进一步在Y组中进行分析。

由表5可知,在Y组中OD600 nm与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为ry22=0.968 2,ry24=0.930 2,ry25=0.960 6,相关性大小顺序是|ry22|>|ry25|>|ry24|;TAN与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为ry32=0.931 7,ry34=0.879 1,ry35=0.985 4,相关性大小顺序是|ry35|>|ry32|>|ry34|;pH与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为ry42=-0.968 6,ry44=-0.903 3,ry45=-0.921 1,相关性大小顺序是|ry42|>|ry45|>|ry44|;NIT与Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相关性系数分别为ry52=-0.952 7,ry54=-0.911 4,ry55=-0.968 5,相关性大小顺序是|ry55|>|ry52|>|ry54|,在Y组中乳酸菌具有较强的降解亚硝酸能力,进一步分析乳酸菌微生物量之和与OD600 nm及理化指标的相关性。

表5 Y组各菌属微生物量与理化指标及OD600 nm的相关性分析

由表6可知,3种乳酸菌微生物量之和与OD600 nm、TAN相关性系数分别为rs乳22=0.991 5,rs乳32=0.966 9,相关性大小顺序是|rs乳22|>|rs乳32|。2种乳酸菌微生物量之和与OD600 nm、TAN、pH相关性系数分别rs乳23=0.897 3,rs乳33=0.940 9,rs乳43=-0.955 7,相关性大小顺序是|rs乳43|>|rs乳33|>|rs乳23|。

表6 S组乳酸菌微生物量与OD600 nm及理化指标的相关性分析

由表7可知,3种乳酸菌微生物量之和与OD600 nm、TAN、pH、NIT相关性系数分别为ry乳22=0.993 2,ry乳32=0.976 0,ry乳42=-0.980 3,ry乳52=-0.985 0,相关性大小顺序是|ry乳22|>|ry乳52|>|ry乳42|>|ry乳32|;2种乳酸菌微生物量之和与OD600 nm、TAN、pH、NIT相关性系数分别为ry乳23=0.993 2,ry乳33=0.975 8,ry乳43=-0.980 4,ry乳53=-0.984 9,相关性大小顺序是|ry乳23|>|ry乳53|>|ry乳43|>|ry乳33|。

表7 Y组乳酸菌微生物量与OD600 nm及理化指标的相关性分析

3 讨论

东北酸菜具有酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口、增进食欲等特点,微生物群落结构的多样性是形成其口感的原因,目前学者为研究菌属结构对发酵蔬菜理化指标的影响,选取不同发酵时间点的发酵蔬菜进行研究[17-19]。本研究将本实验室前期研究成果[20],结合本次实验25 h为S组亚硝峰、15 d为最终发酵时间,因此选取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d的酸菜匀浆作为研究对象,分析OD600 nm、理化指标及菌群结构的变化。15 d发酵结束时(见表8),S组中NIT含量为3.09 mg/L,Y组中NIT含量为11.80 mg/L,低于国家的限量标准。在菌属结构上,uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc是优势菌属,其结果与Rao等[21]的研究结果相似,乳酸菌是发酵过程中的关键菌属,它可以产生有机酸,降低pH[22]。与S组相比较,Y组中TAN减少、pH值增高,该现象与张庆芳等[23]在亚硝酸盐对Lactobacillusbrevis4903发酵中的研究结果相一致。Y组发酵体系内产酸量较低,推测原因可能为乳酸菌产生亚硝酸还原酶将NIT还原为氨气,氨气与乳酸菌所产乳酸反应,导致发酵环境中pH值偏高,TAN含量偏少,有利于发酵早期乳球菌属的生长与积累。

16S rDNA测序技术检测到的相对丰度变化不能准确地反映微生物量的动态变化,因不同样本的微生物总量不同,高通量测序与分光光度计将活菌、死菌同时测量,所以将相对丰度与OD600 nm相结合,分析发酵过程中微生物量的变化。研究发现,发酵过程中相对丰度减少,不能说明其微生物量一定减少,甚至有可能出现增加的情况;相对丰度没有变化,也不能说明微生物量没有发生变化,这与Tkacz等[24]的研究结果一致。表明在利用16S rDNA测序分析菌群结构时,不能只考虑相对丰度的变化,还应关注微生物量的变化。S组和Y组菌落发酵过程中微生物量的变化说明NIT促进了Lactococcus、Leuconostoc的生长,抑制了uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus的生长,在前期减少了肠杆菌属的微生物量,中、后期增加了乳酸菌菌属的微生物量。

相关性分析发现,NIT与OD600 nm有极显著相关性,进一步分析各菌属与理化指标的相关性。uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的生长与pH、NIT呈负相关,与TAN、OD600 nm呈正相关。3种乳酸菌Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus均与pH、NIT呈负相关,与OD600 nm、TAN呈正相关,其中Lactococcus与NIT有显著相关性(ry52=|-0.952 7|>r0.05),Leuconostoc与NIT有极显著相关性(ry55=|-0.968 5|>r0.01),Lactococcus、Leuconostoc与NIT的降解具有较强的相关性。张庆芳等[25]研究发现发酵前期培养液的pH值>4.5时,乳酸菌对NIT的降解以酶降解为主;pH值<4.0后,NIT的降解主要以酸降解为主。通过比较3种乳酸菌和2种乳酸菌与OD600 nm及理化指标的相关性,研究发现在Y组中乳杆菌属相比乳球菌属对产酸、降解NIT能力的影响较小,其原因可能是NIT抑制了Lactobacillus的生长。亚硝酸盐通过影响各菌属的生长,导致TAN、pH在酸菜匀浆中发生变化,进而导致NIT与TAN、pH有极显著相关性。

4 结论

亚硝酸盐与总酸、OD600 nm的相关性为极显著负相关,与pH的相关性为极显著正相关,亚硝酸盐的降解与Lactococcus、Leuconostoc具有较强的相关性,亚硝酸盐促进了Lactococcus、Leuconostoc的生长,乳酸菌属对东北酸菜发酵起到了重要作用,当达到发酵后期时,发酵体系中的亚硝酸盐会被乳酸菌降解至安全值以下,从而消除了人们对东北酸菜中亚硝酸盐安全性的疑虑。