参芪温肺方减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺气虚证：基于调节NLRP3/GSDMD细胞焦亡通路

吴 迪，王小乐，高雅婷，童佳兵，，杨勤军，丁焕章，张 璐，李泽庚

1安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230038；2江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；3安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所//安徽省教育厅中医药防治肺系重大疾病重点实验室//安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以持续性气流阻塞为特征的一种异质性肺部状态［1］，伴咳嗽、咳痰、呼吸困难等慢性呼吸道症状。气道异常导致的慢性气道炎症是COPD的重要发病机制［2］，与有毒颗粒和气体暴露等危险因素密切相关，可诱导多种细胞因子并募集炎性细胞靶向肺组织，从而导致炎症反应的发生［3,4］。被细胞内外信号刺激激活的细胞焦亡作为一种程序性细胞死亡方式，常伴随一系列的炎症反应［5］。研究发现［6］，NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体介导的经典细胞焦亡途径在COPD的发病机制中扮演重要角色。COPD患者外周血单个核细胞中NLRP3 mRNA及血浆中白细胞介素-18（IL-18）和IL-1β表达均显著升高［7］。香烟烟雾可刺激小鼠肺组织中NLRP3 炎症小体相关蛋白NLRP3和凋亡相关微粒蛋白（ASC）的活化，激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1），促进消皮素D（GSDMD）蛋白的裂解，诱导细胞焦亡，释放IL-1β和IL-18，加重COPD小鼠肺组织的损伤和炎性细胞焦亡［8,9］。因此，抑制NLRP3炎症小体的活化，可能是抑制COPD细胞焦亡发生的关键环节。

目前，中医药改善COPD的优势显著，安全可靠［10］。针对COPD气虚病证发展规律的病机认识，第四届国医大师韩明向教授根据新安医家吴楚《补肺汤》化裁而成的参芪温肺方（SQWF，专利号ZL 2022 1 0325914.X），由人参、炙黄芪、干姜、陈皮、白术、桔梗和炙甘草七味中药组成，具有温肺化痰，益气平喘之功效。前期临床观察发现，该方可以有效改善COPD肺气虚证患者的咳嗽、咳痰等症状、减少急性加重次数，提高肺功能等。尽管疗效确切，但作用机制尚不明确。SQWF能否通过干预炎症小体介导的细胞焦亡通路影响COPD尚不清楚。

本文通过构建COPD 肺气虚证大鼠模型，拟从NLRP3炎症小体信号通路阐明SQWF对肺气虚模型大鼠细胞焦亡的影响，探索SQWF改善COPD的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量180±20 g，购自邳州市东方养殖有限公司，许可证号：SCXK（苏）2017-0003。按照标准适应性饲养7 d后进行实验。实验通过安徽中医药大学动物伦理委员会批准（AHUCM-rats-2021087），严格按照国家《实验动物管理条例》执行。

1.2 药品

参芪温肺方药物组成：人参（吉林）10 g、炙黄芪（甘肃）15 g、干姜（云南）6 g、陈皮（福建）10 g、白术（安徽）10 g、桔梗（安徽）6 g、炙甘草（新疆）6 g，购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，中药饮片由该院韩燕全教授鉴定均为正品。每剂药物质量63 g。将参芪温肺方药物加入10倍药物重量的蒸馏水（630 mL）煎煮1 h后将药液过滤倒出，药渣再加入8倍重量蒸馏水（504 mL）煎煮40 min后再次过滤，混合两次药液，按临床等效剂量进行换算［11］制得高剂量生药含量1.134 g/mL，1 mL/100 g灌胃，4 ℃冰箱保存，蒸馏水稀释应用。玉屏风颗粒（国药集团广东环球制药有限公司，国药准字Z10930036，5 g/袋），用生理盐水配置成浓度为0.135 g/mL 的混悬液应用。

1.3 材料与试剂

脂多糖（LPS，Sigma）；雄狮牌过滤嘴香烟（浙江中烟工业有限责任公司，84 mm烤烟型，焦油量：8 mg，烟气烟碱量：0.7 mg；烟气一氧化碳量：10 mg）；苏木素伊红染色液（Biosharp）；RNA快速提取试剂盒、SYBR定量试剂盒、逆转录酶mix（Sparkjade®）；DAB显色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；NLRP3抗体、ASC抗体、IL-1β抗体（Affinity）；GSDMD 抗体、Caspase-1 抗体、IL-18抗体（Proteintech）；大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；IL-18检测试剂盒（Elabscience®）。

1.4 仪器

SH-III-50N型抓力检测仪（南京苏测计量仪器有限公司）；AniRes2005型动物肺功能分析系统（北京贝兰博科技有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；CHL2FM3型倒置显微镜（Olympus）；Sysmex XN-9000 型全自动血液分析仪（日本希森美康公司）；EPOCH2型酶标仪（BioTek）；JXFSTPRP-CLN型冷冻研磨仪（上海拓赫机电科技有限公司）；Centrifuge 5418 R 型高速冷冻离心机（Eppendorf）；Veriti 96-Well Thermal Cycler 型梯度 PCR 仪（ThermoFisher Scientific）；LightCycler480 II型实时荧光定量PCR仪（Roche）；BioSpectrometer®basic 型分光光度计（Eppendorf）；NIKON DS-U3型显微成像系统（Nikon）。

1.5 COPD大鼠模型构建与给药

将大鼠随机分为空白组（Blank）、模型组（Model）、SQWF低（SQWF-L）、中（SQWF-M）、高（SQWF-H）剂量组、玉屏风组（YPF），8只/组。除正常组外，其余各组大鼠采用全身香烟烟雾暴露联合脂多糖气管滴注法构建COPD大鼠模型［12-14］：于造模第1和14 天行气道滴注脂多糖（1 mg/kg），滴注当日不烟熏。造模的第2～28 天（除第1和14 天）将大鼠置于自制烟熏箱中，烟熏1 h/d，空白组不予处理。根据“人与动物等效剂量换算法”计算［15］，于造模第29 天起，SQWF低、中、高剂量组分别给予2.835、5.67、11.34 g/kg 灌胃，玉屏风组给予玉屏风颗粒混悬液1.35 g/kg灌胃，空白组和模型组给予等容积的生理盐水灌胃，各组每日给药1 次，连续给药14 d。

1.6 行为学变化

观察实验期间大鼠的行为学变化，包括活动情况、精神状态、呼吸、毛发、饮食、等，每周称量体质量，比较各组大鼠体质量变化。

1.7 抓力测试

使用抓力检测仪测量造模第0、2、4、7周末大鼠的抓力。固定抓力检测仪，使大鼠前爪抓住前部网格，抓取大鼠尾部轻轻向后拉，读取抓力值，每只大鼠测量3次取平均值，统计分析数据。

1.8 肺功能检测

末次给药结束后，禁食24 h，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉，使用动物肺功能分析系统检测各组大鼠肺功能。大鼠行气管切开连接双通插管后，仰卧于密闭体积描计箱内，保证气管插管和体描箱气路相连顺畅，待气道压力波形稳定后，测定0.3 s用力肺活量（FEV0.3）、FEV0.3/用力肺活量（FVC）和用力呼气峰值流速（PEF），分析评价大鼠的肺功能。

1.9 标本制备与采集

肺功能检测完毕后，腹主动脉取血于含EDTA采血管中，轻轻摇晃，用于血细胞检测。剩余外周血于3500 r/min离心15 min，分离血清保存至-80 ℃医用低温冰箱。取血后，迅速打开胸腔，结扎右主支气管，将4 mL无菌培养基缓慢注入左肺，回抽液体，反复灌洗3次，共回收支气管肺泡灌洗液（BALF）约10 mL，用于炎症因子的检测。取右肺上叶组织，4%多聚甲醛固定，用于苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学（IHC）染色，剩余肺组织用冻存管分装置于液氮快速冷冻，后转移至-80 ℃冰箱保存。

1.10 HE染色观察肺组织病理学改变

将4%多聚甲醛中固定的肺组织经脱水，常规石蜡包埋，制成5 μm切片；然后切片经脱蜡后，常规HE染色，脱水封片，显微镜观察各组大鼠肺组织结构和形态学特征。随机截取6张视野图片，在每个视野中心画“十”交叉线，计算每个视野中相交肺泡隔膜数（Ns）、肺泡数（Na）、划线总长度（L）、面积（S），计算肺泡平均截距［16］（MLI，μm）=L/Ns，平均肺泡数（MAN，个/mm2）=Na/S。

1.11 外周血中炎性细胞检测

使用血液分析仪检测各组大鼠外周血中白细胞计数（WBC）、中性粒细胞百分比（NEU%）、淋巴细胞百分比（LYM%）、单核细胞细胞百分比（MON%）、嗜酸性粒细胞百分比（EOS%）的含量。

1.12 酶联免疫吸附法（ELISA）法检测BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18的含量

取出低温储存的BALF，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。按实验设计，分别设置标准孔组、正常组、模型组、SQWF-L、SQWF-M、SQWF-H组、玉屏风组，各孔加入对应的标准品和待测样品100 μL/孔，然后于每孔加入50 μL稀释的检测抗体（1∶100 稀释）。室温孵育2 h后，丢弃掉液体，洗涤后，每孔加入100 μL酶结合物工作液，室温孵育45 min，洗涤，每孔加入100 μL显色底物TMB，避光，反应20 min后加入100 μL的终止液以终止反应。使用酶标仪检测450 nm波长下各孔的A值，计算各组TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18的表达水平［17］。

1.13 q-PCR 法测定肺组织焦亡关键因子转录水平的表达

使用RNA 快速提取试剂盒提取肺组织总RNA。进行逆转录合成cDNA，PCR反应，扩增，以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的表达倍数。基因引物序列由武汉赛维尔生物科技有限公司合成（表1）。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Sequences of primers used in this study

1.14 免疫组化（IHC）检测肺组织焦亡相关蛋白的定位和表达

将石蜡包埋的肺组织切片进行脱蜡脱水洗涤后，柠檬酸钠孵育，阻断内源性过氧化物酶，3%BSA血清封闭，NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 一抗4 ℃孵育过夜。次日，二抗室温孵育，PBS洗涤后加DAB溶液显色，显微镜下观察，阳性为棕黄色。应用Image Pro Plus软件对图像进行关键蛋白的半定量分析，平均光密度值A（A=IntDen/Area）。

1.15 统计学分析

使用SPSS 23.0对数据结果进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，若数据满足正态分布和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布者采用非参数检验，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较

与空白组相比，模型组大鼠呼吸急促，咳嗽、喷嚏增加，口鼻分泌物增多，可闻及明显的痰鸣音，精神倦怠，活动量减少，行动迟缓，毛发枯黄，饮食量少，大便稀溏，体型消瘦，体质量增长缓慢。造模后第2周起，各烟熏组体质量与正常组相比明显下降（P<0.01），并且持续到造模第7周。第6周起，SQWF及玉屏风组干预后大鼠的症状均有不同程度的改善，咳嗽、喘息明显缓解，饮食有所改善，各给药组体质量较模型组有所增高，给药结束后SQWF-H大鼠体质量与模型组相比显著增高（P<0.05，图1）。

2.2 抓力测试结果

造模第0～2周，空白组、模型组及各干预组之间抓力无显著性差异；第4周起，模型组大鼠抓力较正常组显著降低（P<0.01）；造模结束第7周，SQWF各给药组及玉屏风组大鼠抓力较模型组显著增高（P<0.01，图2）。

图2 各组大鼠抓力比较Fig.2 Comparison of grip strength of rats in each group(g,Mean±SD;n=8).**P<0.01 vs blank group,##P<0.01 vs model group.

2.3 肺功能变化

与空白组相比，模型组大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC及PEF水平均显著降低（P<0.01），与模型组相比，SQWF各组和玉屏风干预后各呼吸功能指标均有不同程度好转，其中，SQWF-M和SQWF-H组FEV0.3和PEF水平显著升高（P<0.01、P<0.05），SQWF虽能提高FEV0.3/FVC水平，但差异无统计学意义；SQWF各组和玉屏风比较差异无统计学意义（P>0.05，图3）。

图3 各组大鼠肺功能比较Fig.3 Comparison of pulmonary function of rats in each group(n=8,Mean±SD).**P<0.01 vs blank group;##P<0.01 vs model group,#P<0.05 vs model group.

2.4 肺组织病理改变

与模型组相比，SQWF各组及玉屏风组肺组织病理损伤均相对减轻，其中以SQWF-H组改善最为显著。空白组大鼠肺泡结构基本完整，形态正常，黏膜及气道壁周围未见充血、水肿，仅见散在个别炎性细胞；模型组大鼠肺泡腔扩大，形态异常，肺泡壁断裂、融合，气道管腔狭窄，腔内可见渗出物，管壁及周围见大量炎症细胞聚集，管壁增厚，部分上皮细胞脱落。与模型组相比，SQWF各组及玉屏风组部分肺泡腔扩大，排列不规则，黏膜上皮细胞脱落减轻，可见少量炎性细胞浸润和水肿。与空白组相比，模型组MAN显著降低（P<0.01），MLI显著升高（P<0.01），SQWF及玉屏风干预后MAN升高，MLI降低（P<0.01），其中以SQWF-H组效果最为显著（图4）。

图4 各组大鼠肺组织结构和病例指标的比较Fig.4 Histopathological observation of the lung tissue and pathological indexes in each group(HE staining,original magnification:×20;n=6,Mean±SD).**P<0.01 vs blank group,##P<0.01 vs model group.

2.5 大鼠外周血中炎性细胞的水平

与空白组相比，模型组大鼠外周血中的WBC、NEU%、MON%的水平显著升高（P<0.01），LYM%显著降低（P<0.01）。与模型组相比，SQWF各组及玉屏风组上述指标均有所改善，其中SQWF-H和玉屏风组改善水平最为显著（P<0.01）。各组EOS%水平均无显著性差异（图5）。

图5 各组大鼠外周血中炎性细胞比较Fig.5 Comparison of peripheral blood inflammatory cells among the groups(n=6,Mean±SD),**P<0.01 vs blank group,##P<0.01 vs model group,#P<0.05 vs model group.

2.6 大鼠BALF中炎症因子水平

与空白组相比，模型组大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量均显著升高（P<0.01），与模型组相比，各SQWF组及玉屏风组BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量明显降低（P<0.01），且下降程度随SQWF剂量增加而变化，呈剂量依赖性（图6）。

图6 各组大鼠BALF中炎症因子比较Fig.6 Comparison of inflammatory factors in the BALF among the groups(n=7,Mean±SD),**P<0.01 vs blank group,##P<0.01 vs model group.

2.7 大鼠肺组织焦亡相关因子转录表达水平

与空白组相比，模型组大鼠肺组织NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β mRNA 的表达显著升高（P<0.05，P<0.01），但Caspase-1和IL-18的表达上调不明显，差异无统计学意义。与模型组相比，SQWF-H组和玉屏风组可显著下调NLRP3、ASC、GSDMD及IL-1β的mRNA水平（P<0.05，P<0.01），SQWF-M 组仅可以显著下调GSDMD及IL-1β mRNA的水平（P<0.01），以SQWF-H组效果最为显著，各治疗组在改善Caspase-1和IL-18 mRNA的水平方面的差异无统计学意义（图7）。

图7 各组大鼠肺组织中焦亡相关因子mRNA的比较Fig.7 Comparison of mRNA expressions of pyroptosis-related factors in the lung tissue of the rats(n=3,Mean±SD),**P<0.01 vs blank group,*P<0.05 vs blank group;##P<0.01 vs model group,#P<0.05 vs model group.

2.8 大鼠肺组织焦亡相关蛋白定位及表达情况

与空白组相比，模型组大鼠肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达显著上调，气道内皮及管壁周围均可见阳性细胞高表达。与模型组相比，各给药组的表达量明显下调，其中以SQWF-H组最为明显（图8，P<0.01）。

图8 各组大鼠肺组织中焦亡相关蛋白的阳性表达Fig.8 Expression of pyroptosis-related proteins in the lung tissue of the rats in each group,**P<0.01 vs blank group,##P<0.01 vs model group.

3 讨论

肺气亏虚贯穿COPD 病程始终［18-20］，发病机制复杂，但与炎症反应息息相关。持续炎症刺激造成肺组织结构退行性病变，诱导不可逆的肺气肿及气道重塑，进而导致肺气虚的产生和发展，最终引起进行性呼吸困难，甚至威胁生命［21］。以NLRP3炎症小体活化介导的细胞焦亡可引发炎症级联反应［22］。

本研究通过吸烟联合脂多糖建立COPD肺气虚证大鼠模型，并给予SQWF进行干预，发现COPD模型大鼠体质量上升缓慢，抓力明显下降，气虚无力症状明显，肺功能减弱，肺气肿改变，炎症小体及焦亡相关因子激活，肺组织及全身炎症反应加重，而经SQWF治疗后，体质量和抓力明显增高，气虚症状缓解，肺功能明显提升，肺气肿有所改善，炎症小体及焦亡相关因子表达下调，炎症反应减轻。提示吸烟联合脂多糖可诱导COPD肺气虚证肺组织焦亡，引发炎症反应，而SQWF对COPD肺组织焦亡有明显的抑制作用，并能有效改善肺气虚炎症状态。

由感觉蛋白NLRP3、适应蛋白ASC 及效应蛋白Caspase-1组成的炎症小体作为细胞焦亡的上游信号［23］，被触发后可促使pro-Caspase-1的成熟活化，继而切割GSDMD，并使其募集至细胞膜上形成孔隙，释放IL-1β、IL-18等炎症因子，诱导细胞焦亡［24］。已有文献报道，NLRP3炎症复合体的激活介导的细胞焦亡可能参与COPD的疾病进程［25,26］。Wang等［9］研究证实，TREM-I可以通过激活NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡来促进COPD 小鼠的肺组织损伤和炎症。本研究结果表明，与COPD肺气虚证模型大鼠相比，给予SQWF和玉屏风均能改善大鼠气虚无力症状，显著抑制肺组织中的炎症细胞浸润，改善肺功能，同时明显下调炎症小体及焦亡关键因子的表达、炎症细胞及因子的分泌。然而，各组Caspase-1和IL-18 mRNA的转录水平有一定趋势但无显著性差异，而在蛋白层面差异显著，考虑可能是由于两种检测方法选取的肺组织不同（qPCR右中、IHC右上），或者是在qPCR过程中实验重复次数较少导致结果误差较大。

玉屏风颗粒已被证实治疗COPD肺气虚证安全可靠，疗效确切，临床应用广泛［10,27］。本研究发现SQWF-H组效果优于玉屏风散，疗效最为显著。表明SQWF方对COPD肺气虚证炎性反应的保护作用确切可靠，其作用机制可能与抗NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡及其下游炎症因子的释放有关。

COPD属中医“肺胀”、“喘证”、“咳嗽”范畴，本团队提出COPD的中医基本病机在于肺气亏虚，痰瘀互结，肺气虚是发病的始动和根本因素，并研制参芪温肺方，可改善COPD肺气虚证患者的临床症状，减少急性加重次数，提高呼吸功能和运动耐力。方中，人参、黄芪为君药，具有补气固表、益肺升阳之功。现代药理学研究发现黄芪的有效成分黄芪甲苷可以下调肺组织Caspase-1，IL-1β及IL-18等焦亡蛋白的表达，削弱炎症反应以拮抗肺纤维化的发展［28］。人参提取物亦可通过调节NLRP3炎症小体发挥神经保护作用［29］。臣药干姜、白术温肺止咳，化痰燥湿，使参芪补而不滞。干姜抑制Caspase家族激活，起到抗凋亡和拮抗炎症的作用［30］。白术可以通过焦亡途径降低IL-1β、IL-18和TNF-α的产生，减轻炎症反应［31］。陈皮，桔梗佐白术理气化痰、补肺畅中。川陈皮素和桔梗均可抑制NLRP3炎症小体的激活，降低IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，减轻炎症反应［32,33］。炙甘草化痰止咳、益气和中、调和诸药，共同起到温肺化痰平喘、抑制细胞焦亡作用。本研究进一步证明SQWF可以抑制肺组织细胞焦亡，改善COPD肺气虚的病理改变。因此，深入研究SQWF治疗COPD细胞焦亡的分子作用机制意义重大。

综上所述，SQWF可能通过阻断焦亡经典途径的激活，降低肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD的表达，控制IL-1β、IL-18炎症因子的释放，从而削弱肺气虚炎症损伤，发挥治疗COPD的效果。该结果为SQWF临床治疗COPD肺气虚证提供依据，且NLRP3炎症小体可能是中医药治疗COPD的理想靶点。