长链非编码RNA H19 促进血管钙化：基于抑制Bax 抑制因子1/视神经萎缩蛋白1通路

陈韦任，杜 辉，沙 媛，周玉杰，梁 静，陈韵岱，马 茜，吴雪萍，钱 赓

1首都医科大学附属北京安贞医院心内12病房//北京市心肺血管疾病研究所//冠心病精准治疗北京市重点实验室//首都医科大学冠心病临床诊疗与研究中心，北京 100029；2中国人民解放军总医院第二医学中心心血管内科//国家老年疾病临床研究中心，北京 100853；3中国人民解放军总医院第一医学中心心血管内科，北京 100853；4清华大学附属北京清华长庚医院心血管内科，北京102218

血管钙化很常见，根据病变位置分为中膜钙化和内膜钙化［1-3］。血管内膜的钙化是影响动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病血管病变和慢性肾脏疾病预后的主要危险因素之一［4-6］。血管钙化的机制目前不是很清楚，可能和血管平滑肌细胞（VSMC）骨型分化、细胞凋亡、钙磷沉积、氧化应激、炎症、线粒体功能和结构的破坏等等有关［7-9］。

长链非编码RNA（lncRNA）是一种长度超过200个核苷酸的功能性RNA分子，它没有编码蛋白质的能力，但它参与各种生物过程，比如染色质修饰、mRNA转录和转录后调控［10-12］。研究表明，lncRNA不仅在正常发育中发挥关键作用，而且还参与血管的病理生理调节［13-15］。LncRNAH19最早被发现参与急性心肌梗死的病理生理过程，过表达lncRNA H19能增加心肌细胞保护作用，进而起到减轻急性心肌梗死的作用［16］。本团队之前的研究发现血管钙化后，lncRNA H19表达明显增高；敲低lncRNA H19后血管钙化减轻，lncRNA H19通过增加VSMC 骨型分化促进血管钙化［17］，但是lncRNAH19下游的调节通路并不是很清楚。

Bax抑制因子1（BI-1）是一种能抑制Bax凋亡因子的调节蛋白，最近研究发现它和血管钙化密切相关［18］。视神经萎缩蛋白1（OPA1）是介导线粒体融合的重要蛋白，主要位于线粒体内膜，对线粒体的形态和功能的稳定起到非常重要作用［19,20］。本团队前期研究发现血管钙化抑制BI-1和OPA1蛋白，增加钙磷沉积、细胞骨型分化蛋白Runt相关转录因子2（Runx-2）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达和细胞凋亡；而激活BI-1/OPA1蛋白通路能抑制钙磷沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，进而减轻血管钙化；基因敲低OPA1蛋白后血管钙化加重［21,22］，而lncRNA H19是否通过BI-1/OPA1通路作用于血管钙化并不清楚。因此我们通过该研究明确lncRNA H19是否通过抑制BI-1/OPA1通路促进钙磷沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡，进而诱导钙化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 β磷酸甘油、氯化钙（Sigma）；胎牛血清（Hyclone）；DMEM（Gibco）；茜素红S染色试剂盒（上海歌凡生物公司）；von Kossa染色试剂盒（北京索莱宝公司）；钙测定试剂盒（北京中生北控生物公司）；凋亡试剂盒（Roche）；RNA提取试剂盒（北京索莱宝公司）；BI-1、OPA1、Runx-2、BMP-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）和β-肌动蛋白（β-actin）（Abcam）；靶向小鼠慢病毒载体H19（si-H19）（北京赛业生物公司）。

1.1.2 实验动物 SD 雄性大鼠（4 周龄，体质量80～100 g）、ApoE-/-小鼠（8周龄，体质量20～30 g）、C57BL/6J小鼠（8周龄，体质量20～30 g）购自北京斯贝福生物技术有限公司。本研究通过中国人民解放军总医院实验伦理委员会批准（伦理审查编号：S2021-099-01）。

1.2 动物模型建立及分组

ApoE-/-小鼠空腹后连续5 d腹腔内注射链脲佐菌素（剂量50 mg/kg，频次1次/d），建立糖尿病模型，糖尿病诊断标准为小鼠连续2 d血糖≥250 mg/dL。ApoE-/-糖尿病小鼠进行高脂饲料喂养32周后，取主动脉弓进行试验［23］。实验分成3组（n=6）：①对照组：C57BL/6J小鼠普通饲料喂养32周；②钙化组：ApoE-/-糖尿病小鼠进行高脂饲料喂养32周；③钙化+siH19组：ApoE-/-糖尿病小鼠在高脂喂养第20周，连续12周腹腔注射100 μLsi-H19［24］。

1.3 VSMC培养和实验分组

1.3.1 VSMC培养 使用SD大鼠提取原代VSMC，简要步骤如下：大鼠经异氟醚麻醉后迅速取胸主动脉，去除外膜后，将血管剪成1～2 mm2小碎块，然后将小碎块放入装有10%FBS和DMEM液体的培养瓶中培养，等细胞长满培养瓶后，去掉小碎块，在孵箱中继续培养。经传3～5代后，将细胞用于试验［25］。免疫组织化学法检测结果提示VSMC纯度>98%。

1.3.2 VSMC钙化模型建立和实验分组 VSMC钙化模型建立：VSMC 使用钙化培养基（含有10%FBS 的DMEM中加入10 mmol/L β磷酸甘油和7.2 mmol/L氯化钙）培养14 d［26］。实验分为5组：①对照组：含有10%FBS的DMEM培养14 d；②钙化组：钙化培养基培养14 d；③钙化＋siH19组：siRNA敲低lncRNA H19表达后，钙化培养基培养14 d；④钙化+siH19+BI-1-/-组：siRNA敲低lncRNA H19和BI-1表达后，钙化培养基培养14 d；⑤钙化+siH19+OPA1-/-组：siRNA敲低lncRNA H19和OPA1表达后，钙化培养基培养14 d。每2 d更换1次培养基。

1.4 细胞转染

按照说明书配制转染液体：将125 pmoL siRNA加入到150 μL OPTI-MEM（Gibco）液体中混匀，另将6.25 μL Lipofectamine 2000（Thermo Fisher公司，美国）加入到150 μL OPTI-MEM中混匀，然后合并混匀上述两种液体，加入到VSMC 中，在培养箱中孵育6～8 h，然后将液体更换为培养基继续培养。转染效果使用qRT-PCR进行验证。

1.5 qRT-PCR实验

收集组织或细胞提取总RNA，分离纯化后使用逆转录试剂盒合成cDNA，然后使用特异性引物进行扩增，在95 ℃下初始变性5 min，然后进行95 ℃30 s、60 ℃30 s和72 ℃30 s，40个循环。使用2-ΔΔCt记录RNA的表达量，每组实验重复3次，以GAPDH来标准化结果。引物序列如下：①lncRNA H19正向：5'-TACAAC CACTGCACTACCTG-3'，逆向：5'-TGACTCCTGTGT TCCTGTTA-3'；②BI-1 正向：5'-CCGGGCACCTAAA GAAGGTCTATGCCTCGAGGCATAGACCTTCTTT AGGTGCTTTTTG-3'，逆 向: 5'-AATTCAAAAAGCA CCTAAAGAAGGTCTATGCCTCGAGGCATAGACC TTCTTTAGGTGC-3'；③OPA1 正向：5'-ACAGCAAA TTCAAGAGCACGA-3'，逆向：5'-TTGCGCTTCTGT TGGGCAT-3'；④GAPDH 正向：5'-ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3'，逆 向：5'-TCCACCACCCTGTTGCT GTA-3'。

1.6 Western blotting实验

使用细胞裂解液裂解VSMC，然后提取细胞总蛋白，取30 μg 加入10%SDS-PAGE 凝胶中进行蛋白电泳，然后将蛋白电转移至PVDF膜。5%BSA液体37 ℃封闭1 h，然后使用一抗4 ℃孵育过夜，1%洗膜缓冲液冲洗后，辣根过氧化物酶标记的二抗室温下反应2 h。应用化学发光试剂与膜反应后，使用软件对蛋白质的表达进行量化分析。

1.7 茜素红S染色

按照试剂说明书，VSMC使用70%酒精固定1 h，PBS 浸洗细胞3 次，然后使用1 mg/mL 茜素红S 溶液37 ℃染色30 min，PBS浸洗细胞3次，等样品干燥后使用相机拍照。

1.8 钙含量实验

按照钙含量测定试剂盒说明书，去除培养液，使用PBS浸洗细胞，先加入样品裂解液，然后加入检测工作液，室温避光孵育10 min，使用酶标仪测定吸光度，计算钙浓度。另取上清液测定总蛋白含量，以钙浓度除以总蛋白含量得出最后数值。

1.9 TUNEL实验

细胞涂片自然晾干，加入4%多聚甲醛（pH=7.4）室温下固定15 min，滴加100 μL的TdT酶反应液于37 ℃湿温盒中孵育60 min，加入终止液室温孵育15 min，PBS浸洗细胞3次，0.3%H2O2浸洗5 min，滴加100 μL辣根过氧化物酶室温反应30 min，PBS浸洗细胞3次，滴加50 μL DAB底物缓冲液，封片剂封片，显微镜下观察染色情况，凋亡细胞细胞核呈棕色。

1.10 Von Kossa染色

小鼠主动脉弓病理切片经过脱水、脱蜡处理后，使用硝酸盐溶液在光的作用下进行照射染色30 min，蒸馏水清洗干净后，置于硫代硫酸钠溶液进行定影，然后使用中性品红进行复染，蒸馏水清洗干净晾干后，使用显微镜观察钙化情况，采用Image-Pro Plus进行分析，测定结果为钙化面积/斑块面积×100%。

1.11 统计学分析

所有试验结果均重复3次，使用SPSS19.0软件进行数据分析。试验结果以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1蛋白通路

β磷酸甘油和氯化钙诱导VSMC钙化后，qRT-PCR结果提示lncRNA H19表达明显上升，而siRNA能明显减少lncRNA H19表达（P<0.001）。Western blotting结果提示VSMC钙化后BI-1和OPA1表达明显下降，而siRNA敲低lncRNA H19表达后，BI-1和OPA1蛋白表达明显上升；另siRNA敲低BI-1后，OPA1蛋白表达再次下降（P<0.001，图1）。

图1 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1蛋白通路Fig.1 LncRNA H19 inhibits BI-1 and OPA1 protein expressions in VSMC calcification.A:Western blotting of BI-1 and OPA1.B: Expression level of lncRNA H19.C: Expression levels of BI-1 and OPA1.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs VSMC calcification,&P<0.05 vs VSMC calcification+siH19.

2.2 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1蛋白通路促进VSMC钙沉积

茜素红S染色结果提示VSMC钙化后形成弥漫性红色钙化结节，siRNA敲低lncRNA H19表达后红色钙化结节消失，抑制BI-1或OPA1蛋白均能诱导红色钙化结节再次生成。ELISA结果提示VSMC钙化后细胞钙浓度显著增多，siRNA敲低lncRNA H19表达后细胞钙浓度显著降低，抑制BI-1或OPA1蛋白后钙浓度再次增多（P<0.001，图2）。

图2 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1通路促进VSMC钙沉积Fig.2 LncRNA H19 promotes calcium deposition by inhibiting the BI-1/OPA1 pathway.A:Changes in Alizarin red S staining.B:Serum calcium level.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs VSMC calcification,&P<0.05 vs VSMC calcification+siH19.

2.3 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1蛋白通路促进Runx-2和BMP-2表达

Western blotting 结果提示VSMC 钙化后Runx-2和BMP-2表达显著上升，siRNA敲低lncRNA H19表达后Runx-2和BMP-2表达显著下降，抑制BI-1或OPA1蛋白后Runx-2和BMP-2表达再次上升（P<0.001，图3）。

图3 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1通路促进Runx-2和BMP-2表达Fig.3 LncRNA H19 increases Runx-2 and BMP-2 protein expression by inhibiting the BI-1/OPA1 pathway.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs VSMC calcification,&P<0.05 vs VSMC calcification+siH19.

2.4 LncRNA H19抑制BI-1/OPA1蛋白通路促进活化caspase-3表达和细胞凋亡

Western blotting 结果提示VSMC 钙化后活化caspase-3表达显著增多，siRNA敲低lncRNA H19表达后活化caspase-3表达显著降低，抑制BI-1或OPA1蛋白后活化caspase-3表达再次增多（P<0.001，图4）。

图4 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1通路促进活化caspase-3表达Fig.4 LncRNA H19 promotes cleaved caspase-3 protein expression by inhibiting the BI-1/OPA1 pathway.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs VSMC calcification,&P<0.05 vs VSMC calcification+siH19.

TUNEL染色结果提示VSMC钙化后细胞凋亡率显著上升，siRNA敲低lncRNA H19表达后细胞凋亡率显著下降，抑制BI-1或OPA1蛋白后细胞凋亡率再次上升（P<0.001，图5）。

图5 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1通路促进细胞凋亡（红色箭头所指为凋亡细胞）Fig.5 LncRNA H19 increases cell apoptosis rate by inhibiting the BI-1/OPA1 pathway.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs VSMC calcification,&P<0.05 vs VSMC calcification+siH19.

2.5 LncRNA H19抑制BI-1/OPA1蛋白通路诱导小鼠血管钙化

动物实验研究标明血管钙化后，lncRNA H19表达增加，BI-1和OPA1 mRNA表达明显减少，钙化面积呈现黑色（von Kossa染色）；而敲低lncRNA H19表达后，BI-1 和OPA1 mRNA 表达明显增加，钙化面积减少（P<0.001，图6）。

图6 LncRNAH19抑制BI-1/OPA1通路诱导小鼠血管钙化（红色箭头所指为钙化结节）Fig.6 LncRNA H19 promotes vascular calcification by inhibiting BI-1 and OPA1 protein in mice.A:Von Kossa staining.B:Ratio of calcification area.C:mRNAexpression levels of lncRNAH19,BI-1 and OPA1.*P<0.05 vs Control,#P<0.05 vs vascular calcification.

3 讨论

最近研究表明，lncRNA H19 和血管钙化密切相关［27-30］。研究提示lncRNA H19通过调节丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶转导通路增加Runx-2蛋白和抑制平滑肌22α和α平滑肌肌动蛋白表达，进而促进血管钙化［31］。有学者同样发现血管钙化诱导lncRNA H19表达增加，而敲低lncRNA H19后，Runx-2蛋白表达下降，VSMC骨型分化减少，血管钙化减轻［32］。本研究进一步证实lncRNA H19 促进细胞骨型分化蛋白Runx-2和BMP-2表达进而诱导血管钙化。另外我们发现lncRNA H19 增加钙沉积和细胞凋亡，促进血管钙化；敲低lncRNA H19表达后钙沉积和细胞凋亡减少，钙化减轻。该研究结果进一步丰富了lncRNA H19调节血管钙化的可能机制。

研究发现lncRNA H19能加快巨噬细胞脂质沉积，进而促进动脉粥样硬化斑块进展，基因敲除lncRNA H19能延缓斑块进展［33］。下调lncRNA H19能通过调节血管平滑肌细胞凋亡减轻动脉粥样硬化斑块损害［34］。研究证实BI-1和冠状动脉粥样硬化密切相关，过表达BI-1能维持线粒体内环境，减轻心肌缺血再灌注损伤，起到保护心脏作用［35］。另外BI-1还能抑制线粒体分裂，保护微循环，减轻再灌注损伤［36］。Yang 等［37］提出lncRNA Punisher能作用于OPA1蛋白调节线粒体内环境，进而影响动脉粥样硬化斑块VSMC凋亡：糖尿病小鼠肾组织lncRNA H19表达增加、线粒体融合蛋白2表达下降，提示lncRNA H19可能通过调节线粒体融合蛋白2影响糖尿病小鼠心肾功能的改变［38］。

而lncRNA H19 和BI-1、OPA1 的研究目前尚没有。本研究发现lncRNA H19能调节BI-1/OPA1蛋白通路：血管钙化后lncRNA H19表达增加，BI-1和OPA1表达明显下降，而siRNA敲低lncRNAH19表达后，BI-1和OPA1 蛋白表达明显上升；lncRNA H19 抑制BI-1/OPA1蛋白通路加重钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡促进血管钙化：siRNA 敲低lncRNA H19 表达后钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡减少，血管钙化减轻；而抑制BI-1或OPA1蛋白后钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡增加，血管钙化加重。

综上所述，本研究证实lncRNAH19通过抑制BI-1/OPA1通路促进血管钙化，其机制可能和促进钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡增加有关，该研究结果将为血管钙化的诊断和治疗提供新的观点和理论依据。本研究局限性在于缺乏深入生物信息学方面的研究，有待于进一步研究。