老年膝骨性关节炎患者血清SIRT1-NT和SIRT1-CT水平及NT/CT比值与疾病严重程度及其诊断价值研究

赵兴东，刘木波，张艳金，邬夏荣（贵州航天医院.骨科；.中心实验室,贵州遵义 563000）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是膝关节异质性滑膜病变，以软骨损伤、退行性变及软骨下骨重建为特征[1]。KOA老年人较为常见，近年来随着我国社会老龄化，KOA的发病率高达8.5%[2]。深入研究老年KOA机制，寻找能够反映老年KOA疾病严重程度及诊断的血清标志物，具有重要临床意义[3]。去乙酰化酶1（sirtuin1，SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的组蛋白脱乙酰酶，能够促进软骨细胞存活和细胞外基质的稳定性，对维持成人软骨健康至关重要[4-5]。近年来发现，SIRT1蛋白在关节炎症发生时水解截短失活，形成SIRT1-N端多肽（NT）（1～131位氨基酸）或SIRT1-C端多肽（CT）（700～747位氨基酸）两种蛋白异质体[6]。研究表明，代谢综合征和脂肪炎症中能够通过天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶1对SIRT1蛋白进行CT截短[7]，而在人和小鼠急性感染性炎症中膝关节软骨细胞中能够通过组织蛋白酶B对SIRT1蛋白进行NT截短[8]。目前老年KOA患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平及NT/CT 比值的临床意义报道较少。本研究通过检测老年KOA患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平及NT/CT 比值，分析三者与老年KOA疾病严重程度及临床诊断意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月～2022年8月期间贵州航天医院诊治的164例老年KOA患者作为研究对象（KOA组）。KOA组患者根据X线检查进行Kellgren-Lawrence(K-L)分级，将KOA组患者分为轻中度组（K-L 2，K-L 2～3级，n=74）和重度组（K-L 4级，n=90）。纳入标准：①患者年龄≥60岁，临床资料完整；②KOA诊断符合2018年《骨关节炎诊疗指南》标准[9]；③本研究经患者及家属知情同意并签字。排除标准：①并发膝关节外伤或手术史；②并发代谢性骨病、感染性关节炎、类风湿性关节炎及痛风等膝关节疾病；③近半月接受糖皮质激素治疗；④并发严重肝、肾等重要脏器病变。以同期健康体检的健康老年人群82例为对照组。KOA组和对照组在年龄、性别、体质量指数、KOA家族史、高血压史、吸烟史及饮酒史之间比较，差异无统计学意义(χ2/t=0.033,0.428,0.691,3.293,0.138,0.214,0.522,均P>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准通过。

1.2 仪器与试剂 人SIRT1-NT，SIRT1-CT试剂盒（武汉伊艾博科技公司）；低速离心机（型号-3612，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；1ml移液枪[艾本德（Eppendorf）上海国际贸易有限公司]；酶标分析仪（HBS-1096B，广州航信科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平检测：留取所有研究对象空腹静脉血5ml，3 000r/min离心5min,离心半径10cm，分离血清。采用酶联免疫吸附实验检测血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平。操作步骤按试剂盒说明书进行。结合标准品的吸光度值（A450nm），对应计算各样品的浓度值。SIRT1-NT，SIRT1-CT正常参考值分别为＜50mg/L、＜25mg/L，根据血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平，计算SIRT1-NT/CT 比值。

1.3.2 观察指标：收集所有研究对象性别、年龄、体质量指数、KOA家族史、高血压史、吸烟史、饮酒史等临床资料。

1.4 统计学分析 应用SPSS23.0统计软件进行数据分析。经K-S正态性检验符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用两独立样本t检验。计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用卡方检验。Spearman秩相关分析血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值与K-L分级的相关性。多因素Logistic回归分析影响老年KOA发生的因素。受试者工作特征曲线分析血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值对老年KOA的诊断价值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KOA组和对照组血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值 KOA组血清SIRT1-NT（7.91±1.43mg/L），SIRT1-CT（2.14±0.36mg/L）及NT/CT比值（3.77±0.48）均高于对照组（3.21±1.20mg/L，1.34±0.25mg/L，2.41±0.43），差异具有统计学意义 (t=25.590，18.055，21.671，均P=0.000)。

2.2 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值与老年KOA患者病情严重程度的关系 重度组KOA患者血清SIRT1-NT（9.23±1.38mg/L），SIRT1-CT（2.30±0.33mg/L）及NT/CT比值（4.21±0.50）高于轻中度组患者（6.30±1.50mg/L，1.95±0.41mg/L，3.23±0.44），差异具有统计学意义(t=13.009，6.057，13.178，均P<0.05)。

2.3 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值与K-L分级的相关性 CKD组患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值与K-L分级呈显著正相关（r=0.645，0.573，0.653，均P=0.000）。

2.4 多因素Logistic回归分析影响老年KOA发生的因素 见表1。以是否发生KOA为因变量（赋值：1=是，0=否），以血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值为自变量引入回归方程，多因素Logistic回归分析结果，血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高是影响老年KOA发生的独立危险因素。

表1 多因素Logistic回归分析影响老年KOA发生的因素

2.5 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值对老年KOA的诊断价值 见表2，图1。SIRT1-NT/CT比值对老年KOA诊断的曲线下面积大于血清SIRT1-NT，SIRT1-CT单一指标，差异具有统计学意义（Z=4.018，2.547，P=0.000，0.011）。

图1 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值对老年KOA的诊断价值

表2 血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值对老年KOA的诊断价值

3 讨论

KOA是常见的退行性骨关节疾病，其特征是关节软骨逐渐退化和丧失。当出现关节疼痛、关节积液等临床症状时，关节软骨多已经发生不可逆的破坏。老年KOA患者的软骨破坏与关节过度的机械应力、软骨细胞衰老密切相关[10]。目前KOA的治疗包括康复训练、非甾体类消炎药或阿片类药物治疗等，但目前药物治疗仅能改善疼痛症状，难以延缓疾病进展[11]。深入研究KOA疾病机制，寻找能够诊断KOA并能评估KOA疾病严重程度的因素，对于老年KOA的临床诊治有重要临床意义。

SIRT1是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，广泛表达于内皮细胞、巨噬细胞及其它炎症组织，能特异性修饰染色质结构，去除组蛋白尾部的乙酰基，促进DNA与组蛋白结合，抑制下游相关基因的表达[12]。SIRT1在关节软骨退行性变、骨质疏松及代谢性疾病等疾病中发挥重要的作用[13]。研究表明，骨关节炎患者的关节软骨下成骨细胞中SIRT1表达降低，敲除小鼠关节软骨中SIRT1的表达能够促进软骨细胞凋亡，抑制细胞外基质中Ⅱ型胶原的产生[14]。此外，也有研究表明，骨关节炎发病过程中，肿瘤坏死因子α能够通过组织蛋白酶B，诱导骨软骨细胞中分子量为115kD的SIRT1蛋白水解为75kD的片段，导致SIRT1蛋白功能失活[15]。因此我们推测，SIRT1在老年KOA患者疾病发生发展过程中可能发挥重要的生物学效应，是潜在的疾病生物标志物。本研究中，老年KOA患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高，这与既往报道结果一致[16]。BATSHON等[16]学者在早期KOA患者中发现血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平升高，是早期诊断老年KOA的血清标志物，但该研究样本含量仅28例，未对中重度老年KOA患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平及NT/CT比值进行研究。骨关节炎发生时SIRT1蛋白能够被组织蛋白酶B及天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶1降解失活，产生分子量为75kDa的SIRT1-NT和SIRT1-CT两种蛋白异质体，SIRT1-NT和SIRT1-CT能够分泌到血清中，导致血清中SIRT1-NT和SIRT1-CT水平升高，而骨关节炎时以SIRT1-NT升高为主，导致SIRT1-NT/CT比值升高。体外研究证实，在条件培养液和促炎细胞因子处理后的衰老软骨细胞凋亡率明显增加，此时培养液中SIRT1 NT/CT比值增加[16]。笔者分析，骨关节炎发生时，长期炎症因子应激导致软骨组织中SIRT1的截短失活，大量SIRT1-NT和SIRT1-CT片段积累，以SIRT1-NT为主，SIRT1不能充分结合细胞色素C，导致线粒体中大量活性氧产生，进而诱导软管细胞死亡[6]。本研究中，血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值与老年KOA疾病严重程度呈正相关，K-L分级越高,血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值越高，提示血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值在KOA的疾病发展中发挥重要作用。分析其机制，衰老软骨细胞可分泌产生衰老相关分泌表型，如分泌白介素1β，肿瘤坏死因子α等促炎细胞因子，促进软骨细胞SIRT1的蛋白水解，导致血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平升高。此外，衰老软骨细胞能够通过分泌衰老相关分泌表型细胞因子，诱导衰老软骨细胞凋亡，促进巨噬细胞、粒细胞等的免疫浸润，加重局部炎症反应，还能够通过“旁观者效应”影响邻近非衰老软骨细胞，导致其合成代谢活动受到抑制，分解代谢活动被激活，细胞外基质被降解，关节软骨的结构和功能损伤，促进关节软骨退变[17]。有学者在老年KOA小鼠模型中，发现重度KOA老年小鼠血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高，而在利用抗衰老药物Senolytic对KOA小鼠进行治疗，发现治疗后血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值均明显降低[18]。因此，SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值能够作为衰老相关血清标志物，有助于反映老年KOA疾病严重程度，是潜在的抗衰老药物治疗及药物治疗有效性评估的靶点，值得临床关注。

本研究中，血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高是影响老年KOA发生的独立危险因素，表明SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值参与促进老年KOA疾病的发生。SIRT1作为经典的抗衰老基因，通过调控线粒体内凋亡通路，抑制软骨细胞凋亡[19]。血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高提示机体中关节软骨细胞抗衰老能力降低，导致关节软骨中细胞外基质降解，促进免疫细胞浸润，加重对非衰老的关节软骨细胞的损伤[20]。本研究中，ROC曲线分析显示,血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值在诊断老年KOA的曲线下面积分别为0.836，0.747和0.884，SIRT1-NT/CT比值对老年KOA的诊断效能大于血清SIRT1-NT，CT单独检测，敏感度和特异度分别为0.701，0.914，提示SIRT1-NT/CT比值对老年KOA具有较高的诊断价值。笔者分析，SIRT1-NT是在关节软骨中被组织蛋白酶B降解，反映关节软骨局部炎症状态，而SIRT1-CT还能够在炎症组织中被天冬氨酸蛋白酶1降解，部分反映机体整体炎症状态，因而SIRT1-NT/CT比值相比于血清SIRT1-NT，SIRT1-CT单独检测，能更好地反映老年KOA患者关节软骨的炎症水平。因此，SIRT1-NT/CT比值对老年KOA的诊断具有一定的临床价值，有望成为新的老年KOA诊断的血清生物标志物。

综上所述，老年KOA患者血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高，三者表达与老年患者KOA疾病严重程度呈正相关。血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值升高是影响老年KOA发生的独立危险因素，对老年KOA具有较高的诊断价值，是潜在的早期诊断老年KOA的血清标志物。临床医生可参考血清SIRT1-NT，SIRT1-CT水平及NT/CT比值对老年KOA的发生风险进行评估，对于高危患者予以早期预防和早期诊治，以延缓老年KOA疾病进展，改善临床预后。但本研究也存在一定的不足，本研究为回顾性研究，未对老年KOA患者治疗过程中血清SIRT1-NT，SIRT1-CT及NT/CT比值的变化进行动态分析，有待今后设计前瞻性临床试验进一步研究。