疑似肺炎患者BALF样本应用tNGS技术进行病原学诊断的价值研究

颜新生，张 丹，王 栋，张李涛，张真路，连姝文（武汉亚心总医院 .检验科；.药学部，武汉 430056）

感染是仅次于缺血性心脏病的全球第二大死亡原因，减少感染造成的死亡负担是全球公共卫生的紧迫优先事项[1]。快速准确地鉴定感染病原体是有效治疗感染的关键[2]。由于致病病原体种类繁多，微生物培养鉴定、涂片染色、抗原抗体检测等传统方法均存在一定的局限性，难以及时有效的对病原体进行检出。近年来，除宏基因组高通量测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）技术外，新开发的靶向高通量测序（targeted nextgeneration sequencing，tNGS）技术也开始用于病原微生物检测。tNGS技术是将超多重PCR与高通量测序技术相结合，对样品中的核酸进行多重PCR扩增，再对这些扩增产物进行高通量测序分析的检测技术。tNGS可同时检测样本中几十至几百种常见病原微生物及其耐药基因，因此受到临床的广泛关注，但相关报道较少，诊断价值尚不十分明确。本研究旨在通过比较tNGS和传统方法在疑似肺炎患者支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）等样本中的检出情况来评估tNGS技术在肺炎病原学诊断中的价值，以期为tNGS技术的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2022年7月～2023年3月武汉亚心总医院收治的102例疑似肺炎并行支气管镜检查的患者为研究对象，其中男性59例，女性43例；中位年龄58（34，71）岁。纳入标准：①因疑似肺炎住院；②入院后行支气管镜收集BALF样本送tNGS检测并同时送微生物培养检测；③有其他相关样品可按标准程序进行常规病原学检测；④受试者及其家属知情同意。排除标准：①样本污染或不合格；②受试者临床资料不完善。本研究为回顾性分析研究，研究符合医学伦理学标准。

1.2 仪器与试剂 核酸提取试剂盒（美基生物，货号R6672B-F）；呼吸道病原微生物多重联合检测试剂盒（金圻睿公司，货号KS608-100HXD96）；哥伦比亚血琼脂培养基（广州迪景，货号LS0109）；曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒（丹娜生物，货号DNK-1402-2）；甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（广州万孚）；嗜肺军团菌抗体检测试剂盒，腺病毒抗体检测试剂盒，呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，肺炎支原体抗体检测试剂盒,肺炎衣原体抗体检测试剂盒（安图生物）；结核分支杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒（塞沛公司，货号GXMTB/RIF-CN-50）；自动化核酸提取仪（济凡生物，型号PuriferHT）；PCR仪（苏州东胜，型号ETC811plus）；二代测序仪（金圻睿公司，型号MiniSeqDx-CN）；VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统，VUTEK MS微生物质谱检测系统（生物梅里埃）；A2000 Plus化学发光分析仪（安图生物）；IFlash 3000化学发光分析仪（亚辉龙）；HB-100E酶联免疫分析仪（丹娜生物）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及临床资料收集：所有患者行支气管镜检查并收集BALF样本，将BALF样本同时送检微生物培养和tNGS检测；通过病案管理系统查询患者同时期送检的其他样本病原学检测结果并记录。

1.3.2 tNGS检测：取疑似肺炎患者其中一份BALF样本送金域医学进行呼吸道153种病原体检测。将BALF样本彻底混匀后，取1 300μl在12 000r/min条件下离心5min，弃600μl上清；用移液器混匀底部体系，取400μl使用磁珠法抽提试剂盒提取总核酸（DNA+RNA）；采用超多重PCR技术，对目标序列进行靶向扩增富集，形成无需打断的短片段核酸；产物纯化后加入接头，进行第二轮PCR扩增构建文库，并使用超微量分光光度计进行文库质控后上机测序；测序完成后经过数据分析最终形成报告。本研究中tNGS检测范围包括65种细菌、68种病毒、3种支原体、3种衣原体和14种真菌，见表1。

1.3.3 传统方法检测：传统检测包括细菌培养鉴定、真菌培养鉴定、涂片革兰染色、涂片抗酸染色、甲乙型流感病毒抗原检测、呼吸道7项抗体检测、血清半乳甘露聚糖检测（GM试验）和结核分枝杆菌基因检测（Gene Xpert）。其中呼吸道7项抗体检测包含甲乙型流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、嗜肺军团菌和腺病毒抗体检测。取疑似肺炎患者其中一份BALF样本进行常规微生物培养、涂片染色和Gene Xpert检测，取患者静脉血样本进行GM试验和抗体检测，取患者咽拭子样本进行甲乙型流感病毒抗原检测。阳性判断标准参照各厂家试剂盒说明。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0软件作为数据统计分析工具。Kolmogorov-Smironv法对数据进行正态性检验，非正态分布计量资料以中位数（四分位区间）[M（P25，P75）]表示；计数资料以n（%）表示，组间阳性率比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tNGS与传统方法检出的病原体分布情况 见表2。在102份样本中，tNGS共检出37种245株病原微生物，其中细菌103株（42.04%）、病毒80株（32.65%）、真菌33株（13.47%）、分枝杆菌14株（5.71%）、肺炎支原体12株（4.90%）、鹦鹉热衣原体3株（1.22%）。微生物培养共检出18种42株病原体，其中细菌27株（64.29%）、真菌15株（35.71%）。本研究传统方法检测包括BALF样本的微生物培养结果和其他传统方法检测结果两部分。除培养法外，其他传统方法还检出肺炎支原体抗体阳性7例、甲型流感病毒抗原阳性7例、GM试验阳性7例、涂片抗酸染色阳性7例和Gene Xpert阳性4例，共计32例。

表2 tNGS与培养法检测的病原体分布情况[n(%)]

2.2 tNGS与传统方法检测结果比较 对102例患者tNGS检测结果与微生物培养结果联合其他传统方法检测的结果进行比较，存在以下三种情况：①双阴性7例（6.86%）；②单阳性35例（34.31%），表示tNGS检测结果阳性，而传统法检测结果阴性；③双阳性60例（58.82%），其中双阳性具体分为以下三种情况：ⓐ两种方法结果完全符合（47.6%）；ⓑ两种方法结果部分符合（42.9%），即两种方法检出的病原体至少有一种是相同的；ⓒ两种方法结果完全不符合（9.5%）。在102例患者中，tNGS检出阳性95例（93.14%），高于传统方法检出的60例（58.82%），差异有统计学意义（χ2=32.903，P＜0.001）。在混合感染检测方面，tNGS检出71例（69.61%），高于传统方法检出的12例（11.76%），差异有统计学意义（χ2=70.708，P＜0.001）。两种方法的病原体分类检出情况比较见表3。tNGS在细菌、病毒方面的检出率高于传统方法，差异有统计学意义（均P＜0.001）；两者在真菌、支原体和结核分枝杆菌中的检出率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表3 tNGS与传统方法检测结果比较[n(%)]

3 讨论

本研究通过对BALF样本的tNGS检测和传统方法检测，回顾性评估了tNGS在肺部感染中的诊断价值，发现tNGS诊断肺部感染性疾病较传统方法更加快速、全面，可帮助临床早期明确病原学诊断，指导抗生素的合理使用。

本研究结果显示，tNGS检测的总体阳性率（93.14%）明显高于传统检测方法阳性率（58.82%）。在WU等[3]的一项前瞻性多中心研究中发现，mNGS病原体检出率为90.3%，其他方法为39.5%，mNGS检测获得了较高的微生物检出率，与本研究结果较为一致。另外，本研究tNGS还检测出了较高的混合型感染比例，该结果与其他mNGS检测技术临床应用评估报道基本一致[4-5]。这主要是因为与传统病原学检测方法相比，tNGS或mNGS均是基于高通量测序技术检测样本中的病原体，具有灵敏度高和覆盖广的方法学优势。

在细菌检测方面，本研究tNGS与培养法检出的细菌种类相近，但检出率显著高于培养法，这说明涵盖153种病原体的tNGS可以较好地覆盖临床常见菌，且具有更高的敏感度，DAI等[6]通过比较tNGS法与培养法在100例痰样本中的阳性率印证了本研究结果。本研究中通过较为理想的BALF样本来进行tNGS检测和微生物培养的比较，能提供更有价值的诊断信息，因为与痰液相比，BALF来自上气道消化道的微生物污染更少[7]。在病毒检测方面，tNGS检出的病毒数量远高于传统方法，其中检出最多的是人类疱疹病毒4型和人类疱疹病毒5型，该结果与HUANG等[8]的研究结果一致，病毒培养非常困难以及常规PCR检测通量不足，是传统方法在病毒方面的检出率远低于tNGS的重要原因。在真菌、支原体和结核分支杆菌检测方面，SHI等[9]对110例肺结核疑似病例BALF的检测效果研究发现mNGS与Xpert和培养敏感性相近；而MIAO等[10]报道mNGS在真菌检测方面的敏感性显著优于传统的培养法。本研究中两种方法在真菌、支原体和结核分支杆菌的检出率差异无统计学意义，这可能是因为本研究的传统方法中纳入了GM试验、Gene Xpert，抗原抗体等多种检测方法，其中Gene Xpert本身作为一种基因扩增方法，对结核分枝杆菌检测有较高的敏感度[11]；其次真菌是厚壁微生物，核酸提取较为困难，破壁不充分会影响真菌的检出；第三，相关病原体检出较少可能会导致统计学差异不显著。在特殊病原体检测方面，tNGS检出了鹦鹉热衣原体、嗜肺军团菌、惠普尔养障体等少见病原体，而未在传统方法中检出，主要是因为这些病原体在常规微生物检测中常受到培养条件和方法的限制。

大量研究已证实mNGS应用于临床大大提高了病原体的检出率[12-15]，但mNGS价格昂贵[16]，难以在临床普及[17]。tNGS作为mNGS技术的补充，虽然检测覆盖的病原体范围有限，但相关研究表明tNGS与mNGS在下呼吸道样本总体微生物检出率方面没有显著差异，两种方法检出的微生物分布整体一致[18]。与mNGS相比，tNGS能在一次检测中兼顾DNA和RNA检测流程，较低的测序数据量带来测序成本的下降，因此更具卫生经济学价值[19]。此外，有报道显示2019年全球1 370万例感染相关死亡中770万例死亡仅与33种细菌病原体有关，占当年所有感染相关死亡病例的56.2%[20]，同时，医院不同科室病原菌感染具有多样性和区域性[21]，因此，涵盖临床绝大多数常见病原体、性价比高、可定制化的tNGS可能具有更广泛的临床适用性。

本研究也存在一定的局限性：首先，本研究为单中心研究，样本量有限，支原体和结核分枝杆菌的检出率比较可能存在统计学偏颇，研究结果有待更大样本量的研究进一步证实。其次，采用呼吸道感染检测中比较理想的BALF样本来评价tNGS在疑似肺炎患者病原体检测中的应用价值，除BALF样本外的其他样本类型有待进一步研究。

综上，与传统方法相比，tNGS技术可以有效提高疑似肺炎患者BALF样本中的病原体检出率，尤其在细菌、病毒和混合感染等方面可作为传统病原学检测方法的重要补充，为临床提供快速准确、经济有效的诊断依据。