核酸质谱技术对辐射相关基因单核苷酸多态性多重检测方法的构建及验证

郝文霞，张阳东，宋丽杰，高 峥，牛冬梅，楚瑞雪

（1.火箭军特色医学中心，北京 100088；2.火箭军96606部队医院，河南洛阳 471003；3.解放军总医院京中医疗区礼士路门诊部，北京 100820）

电离辐射可对生物体产生重要影响，但不同机体之间的生物学效应存在差异。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性[1]，可造成不同个体对辐射敏感性的差异。目前国内外有关电离辐射与SNP的相关性研究多集中在肿瘤患者对放射性治疗的敏感性和放射损伤风险的研究，并只体现在某种基因单个或几个位点上，也有核工厂工人和医疗机构辐射从业人员的损伤研究，但不同研究中射线的类型不同且判断辐射损伤的标准也不同。因此，构建基于同一实验方法和判断标准的高通量辐射损伤相关SNP的检测方法很有必要。核酸质谱法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）技术，具有高灵敏度、高精确度和高通量等优势，是当前公认的SNP分型的金标准[2]。本研究根据文献报道，筛选与辐射相关多个基因多个SNP，设计合成引物，应用核酸质谱技术构建高通量、高分辨率、快速的检测方法，为筛选辐射损伤相关标志物、早期发现辐射损伤易感个体及降低辐射损伤风险提供技术平台。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2020年4～6月火箭军特色医学中心75例健康官兵为研究对象，纳入标准：年满18周岁，汉族，男性，无恶性血液系统疾病史，三个月内未曾行放疗或化疗，2周内未曾行X线检查。所有受试者均征得知情同意，并且该研究经火箭军特色医学中心伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 DP-TOF核酸质谱仪（杭州迪普公司），DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，双脱氧核苷酸（TaKaRa Bio公司），其余PCR扩增和单碱基延伸反应所用仪器和试剂参见文献[3]。

1.3 方法

1.3.1 辐射相关多个基因单核苷酸筛选：检索国内外数据库内辐射敏感基因相关SNP的研究，包括：PubMed，中国知网，维普和万方数据库，关键词为“辐射”与“SNP”，检索时间截止2020年4月。根据文献报道，筛选出共济失调性毛细血管扩张症突变基因（ataxia telangiectasia-mutated，ATM），人类X线交叉互补修复基因1（X-ray repair cross complementing 1,XRCC1），人类X线交叉互补修复基因3（X-ray repair cross complementing 3,XRCC3），人类X线交叉互补修复基因6（X-ray repair cross complementing 6,XRCC6），8-羟基鸟嘌呤糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase,hOGG1）,转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1），肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor alpha-like,TNF-α），谷胱甘肽S转移酶P1（glutathione S-transferase pi 1,GSTP-1），4D磷酸二酯酶（phosphodiesterase 4D,PDE4D），切除修复交叉互补基因2（ERCC excision repair 2 ,XPD），切除修复交叉互补基因5（ERCC excision repair 5,XPG），腺苷酸二磷酸核糖转移酶（adenosine diphosphate ribosyl transferase,ADPRT），DNA连接酶4（DNA ligase 4,LIG4），DNA损伤识别修复因子（DNA damage recognition and repair factor,XPA），补体因子H（complement factor H,CFH），O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）和mutS同源蛋白6（mutS homolog 6,MSH6）等17种基因28个SNP。

1.3.2 SNP多态性分析：静脉采集外周血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝，按照天根全血抽提试剂盒的说明书提取人外周血白细胞DNA。引物由上海百力格生物技术有限公司合成。多重PCR扩增及纯化实验过程参见文献[3]。单碱基的延伸反应由依次在反应液中加入2 μl针对SNP位点的特异性单碱基延伸引物、延伸缓冲液、双脱氧核苷酸、DNA聚合酶和灭菌双蒸水配制的延伸液完成。延伸反应条件：95℃ 30s，进入40次循环（95℃ 5s，52℃5s），72℃保温3min。加入脱盐树脂对延伸产物进行脱盐纯化，脱盐后将样本点在靶板基质上形成共结晶，再应用DP-TOF型飞行时间质谱检测系统进行基因分型。根据每种单碱基质量不同而到达分析器的时间不同，智能分析每个位点的基因型。实验相关的基因名称、编码，SNP编码、突变类型以及多重PCR和单碱基延伸引物序列见表1。

表1 SNP相关的基因、突变类型和引物序列

1.3.2 Sanger测序验证：为检验MALDI-TOF-MS技术的准确度，筛选其中7份样本进行Sanger测序验证，测序由杭州尚亚赛生物科技有限公司完成。

2 结果

2.1 SNP分型的检出率 通过对75份外周血DNA的28个SNP进行基因分型，共2 100个SNP位点的基因分型检出率为100.0%，检测结果见表2。以rs25487和rs4988044为例，SNP的核酸质谱法检测结果见图1。

图1 SNP的质谱聚类图

表2 MALDI-TOF-MS检测结果（n=75）

2.2 SNP分型的准确度 对其中7份样本共196个SNP位点的核酸质谱分型结果进行测序验证，两种方法的结果符合率为100.0%。以TGF-β1基因rs1800469的A>G基因型为例，核酸质谱法和测序法的检测结果见图2。

图2 TGF-β1基因rs1800469的A>G基因型核酸质谱法和测序法结果图

3 讨论

染色体畸变被认为是反映辐射损伤的敏感指标，但同一群体在相同的辐射环境和防护措施下，其染色体损伤情况并不相同。其次，长期接触低剂量射线，染色体损伤程度并无明显加重。随着分子检测技术的发展，研究者发现基因的多态性可造成放射敏感性的差异。DNA损伤修复能力的差异是决定该个体遗传损伤易感性的一个重要因素。XPG与XPD属于同一家族基因，参与DNA修复和DNA重组。国外的研究结果显示XPD 的rs13181 GG 基因型和XPG的rs17655 GG 基因型是辐射敏感性的标志物[4]。XRCC家族基因是碱基切除修复、单链断裂修复系统中重要的DNA修复基因，是DNA 完整性的关键[5-6]。王良群等[7]应用多聚酶链反应-限制性长度多态性分析技术发现XRCC1基因多态性可能是辐射致染色体损伤的危险因素。DNA双螺旋断裂被认为是电离辐射致细胞杀伤、染色体畸变及诱发癌症最严重的损害[8]。ATM基因对辐射的敏感性体现在突变或失活后导致的基因功能的不稳定性和DNA双链受损修复过程发生障碍。赵君彦等[9]采用基于荧光标记单碱基延伸分型技术对ATM基因的rs373759,rs189037和rs4988044三个位点进行基因分型，发现rs189037位点GA/AA基因型的个体放射敏感性增加。

本研究根据文献筛选的17种基因与氧化应激反应、DNA损伤修复途径和维持基因组稳定性有关。SNP是一种遗传变异类型，不同种族的基因型频率不同，目前还未见中国汉族人群多基因多位点间关联性与辐射敏感性之间的交互作用研究。因此，构建一种可同时检测多位点的高通量的实验方法可为早期发现辐射敏感个体提供技术支撑。

核酸质谱仪主要由进样系统、基质辅助激光解吸电离离子源(（matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)、飞行时间质量分析器(time of flight mass analyzer,TOF)、检测接收器和配套分析软件共五部分组成。核酸质谱分析SNP技术的工作原理见文献[1]，其优势在于可满足不同检测量的需求，快速大范围检测的同时还能保证高灵敏度。其次，检测成本低，不需要荧光类试剂。基于高通量、快速、准确的特点，核酸质谱仪已被广泛应用于出生缺陷防控[10-12]和个性化精准医疗[13-15]以及某些疾病的发病机制研究。在传染性疾病诊断领域[16-18]，核酸质谱检测法有更高的准确度和特异度，可以降低临床漏诊率，对于病原体的快速鉴定具有重要意义。糖尿病和冠心病等非传染性疾病也是当前社会面临的重要健康问题，核酸质谱技术在早期风险因素的筛查中发挥了重要作用[19-22]，为疾病的预防和控制提供一定的依据。

本实验通过对75份样本共2 100个SNP位点进行基因分型及对7份样本共196个SNP位点的测序验证，结果显示应用核酸质谱技术构建的检测17种基因28个SNP的方法的检出率和准确度均为100%，该方法具有快速、稳定、高通量、价格低廉且操作简便的优点。根据优化后的实验条件，作者申报的《同时检测多个辐射敏感性相关SNP位点的试剂盒》已获授权国家发明专利（专利号：ZL 2020 1 0929474.X）。在后续的研究中，将以染色体畸变等作为辐射损伤的判断指标，应用构建的SNP检测方法，验证并筛选与辐射损伤敏感性相关显著的SNP和标志物，从而实现早期发现辐射易感个体，保护易感人群的健康，达到预防职业病的效果。