宏基因组二代测序对结缔组织病并发肺部感染的病原学诊断价值研究

孙 莉，马 艳，厉小梅，王 俐（中国科学技术大学附属第一医院风湿免疫科，合肥 230000）

结缔组织病（connective tissue diseases，CTD）是一种由免疫介导的慢性炎症性疾病，肺是常见的受累器官之一，主要表现为肺间质病变[1]。肺部感染是CTD患者的常见死因[2-3]，激素、免疫抑制剂和生物制剂的使用，以及自身免疫功能紊乱均可导致感染风险增加。在CTD患者肺部感染早期明确病原学有助于靶向使用抗生素，改善预后。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种高通量测序技术，可以广泛应用于外周血、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等多种临床样本的各种微生物检测，具有不受培养条件限制，可以覆盖传统方法难以检测到的罕见病原体等优势，在感染性疾病早期明确病原体方面发挥重要作用[4-5]。CTD患者作为免疫紊乱人群，肺部感染具有自身临床特点，本文旨在分析mNGS在CTD并发肺部感染病原学诊断中的临床价值，为mNGS的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究为回顾性病例对照研究，选取2019年5月～2022年5月中国科学技术大学附属第一医院风湿科住院的诊断为肺部感染的CTD患者。纳入标准：①同时进行mNGS和传统病原学检测；②临床资料完整。排除标准：①并发恶性肿瘤；②妊娠期、哺乳期妇女。肺部感染由风湿免疫科3位主治医生组成的专家小组共同根据患者临床症状、传统和血清病原学检测结果、mNGS报告、胸部CT表现、抗生素疗效及以往的临床诊疗经验，并参考中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）[6]综合判断。

共纳入符合标准的患者73例，其中男性18例（24.66 %），女性55例（75.34 %），年龄16～86（55.73±15.65）岁，平均住院日20.52±12.14天。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）22例（30.13%），皮肌炎/多肌炎（dermatomyositis and polymyositis/dermatomyositis，DM/PM）16例（21.92%），类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）10例（13.70 %），ANCA相关性血管炎（ANCAassociated systemic vasculitis，AAV） 10例（13.70 %），舍格伦综合征（sjogren syndrome，SS）9例（12.33 %），未分化CTD（undifferentiated connective tissue disease，UCTD） 6例（8.22%），依据美国感染病学会/美国胸科协会重症社区获得性肺炎的简化标准[7]，重症肺炎44例，轻症肺炎29例。

本研究获得中国科学技术大学附属第一医院医学研究伦理委员会批准（编号：2022-RE-356），所有患者均签署了知情同意书。

1.2 方法 通过医院His系统收集患者性别、年龄、诊断、mNGS，传统病原学检测结果、血清学指标。患者住院期间清晨采集外周静脉血、痰液或BALF进行传统病原学及mNGS检查。传统病原学检测包括血培养、痰细菌及真菌培养、痰抗酸染色、痰六胺银染色、EB病毒（epstein-barr virus，EBV）和巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-DNA定量、TB-GeneXpert。mNGS通过MGISEQ-2000基因测序仪（深圳华大智造科技股份有限公司），采用高通量测序技术，对样本中的核酸进行提取和测序，与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，参考中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[4]进行mNGS和传统检测结果的判读。

1.3 统计学分析 采用SPSS24.0软件进行分析，非正态分布的计量资料以中位数（四分位距）[M（IQR）]表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以n（%）表示，组间比较采用卡方检验和配对卡方检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS与传统病原学检测的检出率和检测时间比较 mNGS共61例（83.56%）检出病原体，传统检测共42例（57.53%）检出病原体，差异有统计学意义（χ2=10.452，P=0.001）。其中两种方法均阳性36例（49.31%），均阴性6例（8.22%）。mNGS平均检测时间少于传统病原学培养[25（5）h vs 120（48）h]，差异有统计学意义（Z=-10.155，P<0.001）。

2.2 mNGS与传统病原学检测检出病原体分布 见表1。mNGS共检出病原体154株，以病毒（75株，48.70%）和真菌（41株，26.62%）为主。传统检测共检出病原体65株，以真菌（31株，47.69%）和细菌（21株，32.31%）为主。

表1 mNGS与传统病原学检测检出病原体分布

2.3 mNGS与传统病原学检测、病原体检出率比较 73例CTD并发肺部感染患者mNGS病毒[44（60.27%）]和真菌[38（52.05%）]检出率高于传统检测[13（17.81%），25（34.25%）]，差异有统计学意义（χ2=23.077，4.966，P<0.001，0.026），mNGS细菌检出率[25（34.25%）]与传统检测方法[18（24.66%）]无明显差异（χ2=1.440，P=0.230）。

mNGS 2种及以上病原体检出率（39/73，53.42%）高于传统病原学检测（10/73，13.70%），差异有统计学意义（χ2=22.400，P<0.001）。mNGS检出的混合感染以真菌混合病毒为主（20/39，51.28%），传统检测检出的混合感染以真菌混合细菌最常见（5/10，50.00%）。

2.4 不同严重程度肺炎患者病原体分布 见表2。44例重症肺炎患者中，mNGS结果阳性42例，共检出病原体107株，以病毒及真菌为主；传统检测结果阳性30例，共检出病原体46株，以细菌和真菌为主。29例轻症肺炎患者中，mNGS结果阳性19例，共检出病原体47株，以病毒及真菌为主。传统检测结果阳性12例，共检出病原体19株，以细菌和真菌为主。mNGS（95.45% vs 65.52%）和传统检测（68.18% vs 41.38%）两种检测方法，重症肺炎组的病原体检出率均高于轻症肺炎组，差异有统计学意义（χ2=11.608，5.139；P=0.001，0.023）。

表2 不同严重程度肺炎患者病原体分布[n（%）]

3 讨论

结缔组织病（CTD）是一组免疫介导的慢性炎症疾病，感染及病情活动是此类患者反复住院的主要原因[8-9]。呼吸道是最常见的感染部位[10]，细菌、病毒、真菌和支原体等多种病原体均可引起呼吸道感染[11]，但依据临床表现和影像学检查通常难以准确鉴别，即使结合了培养和非培养技术，免疫功能低下患者严重肺炎的病因诊断也难以明确。

宏基因组二代测序（mNGS）基于NGS平台，能够快速获取临床样本中的全部核酸序列，通过与特定的数据库比对，分析样本中微生物的种属信息，受抗生素影响小，能够同时识别样本中的所有潜在传染源[12]，在发现新型和罕见病原体，诊断不明原因和混合呼吸道感染性疾病方面具有明显优势。研究发现，既往使用抗生素的患者mNGS的敏感度显著高于微生物培养[13]。还有研究显示，mNGS对传统病原学检测方法无法检测或敏感度较差的病原体和病毒有较高的检测效率[14]。本研究中，mNGS病原体和2种及以上病原体检出率高于传统病原学检测。重症肺炎多为复杂感染，此类患者疾病复杂性和采样前抗生素暴露使病原体检测更加复杂[15]，本研究重症肺炎组病原体检出率高于轻症肺炎组，说明mNGS可一次性无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体等病原体，对发现混合型感染更有优势[16]。

CTD患者免疫紊乱，感染进展快，早期精准治疗尤为重要。虽然传统病原学培养可以完善药敏试验指导用药，但是对于危急重症患者时效性较差，不利于及时予以抗感染治疗，甚至丧失抢救时机。本研究显示，mNGS检测时间显著少于传统病原体培养。mNGS检测结果一般可在24～72 h内获得，而传统病原学检测耗时长，一般需要3～5天，阴性结果常需要7天，分枝杆菌甚至需要45天。应用mNGS可在早期明确感染病原体，有效指导抗生素的合理应用，缩短住院时间[17]。

mNGS可对血液、脑脊液、BALF，活检组织等多种临床标本进行检测。本研究中mNGS标本来源于血浆和BALF。临床上部分患者不能耐受有创检查，血浆mNGS创伤小，更易采集，已被广泛应用于临床感染性疾病的诊断[18]，但血浆mNGS对于肺炎的诊断价值尚存在争议。研究显示，BALF mNGS在病原体检测方面优于血浆mNGS，对重症肺炎患者中的诊断准确率高于血浆mNGS，但血浆mNGS在识别病毒方面具有优势[19]。本研究中mNGS的病毒和真菌检出率均高于传统病原学检测。因此，当临床上怀疑病毒和真菌感染且难以获取BALF时，血浆mNGS是一个良好的选择。但由于难以破除多糖细胞壁而提取DNA，mNGS鉴定曲霉和隐球菌仍是一个挑战[20]。

mNGS目前亦存在以下劣势：检测费用较传统病原学检查明显高，不能进行药敏，不能对病原体耐药性进行指导。mNGS检测报告提供疑似病原体列表，此类病原体主要包括检出序列数低的可能病原体、环境中常见机会致病菌、常见院内感染致病菌以及可能致病的人体定植病原菌，需结合临床进行鉴别。综上所述，CTD并发肺部感染患者中，mNGS的病原体检出率高于传统病原学检测，检测时间更短，有助于快速全面地检测和鉴定病原体、明确感染诊断，指导临床治疗。