卵巢功能减退患者卵泡液外泌体差异表达miRNA筛选及生物学功能分析

沈开元，曲晓力，代小丽，黄 萍，邹乾兴，梁媛媛，罗平（1.柳州市人民医院 a.生殖医学科；b.科研科，广西柳州 545006；2.柳州市生殖与遗传代谢性疾病重点实验室，广西柳州 545006）

卵巢功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）患者主要表现为卵巢储备和卵母细胞质量下降，致使患者在辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）治疗过程中出现卵巢低反应，卵母细胞非典型受精和胚胎着床失败等异常，最终导致周期取消率增加、怀孕率降低等ART不良结局的发生。卵泡发生和卵母细胞成熟是女性妊娠的关键事件，主要在卵泡液微环境中发生，因此卵泡液是了解DOR患者生育力下降原因的绝佳样本。此外，证据表明卵泡液外泌体中的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）参与调控卵母细胞减数分裂恢复、卵泡闭锁凋亡以及表观遗传修饰等生物学进程[1]，对外泌体miRNA的研究有助于探明DOR发生的具体作用机制。因此，本研究利用miRNA PCR阵列芯片技术筛选DOR患者卵泡液中差异表达的外泌体miRNA，结合生物信息学分析其潜在的分子功能和调控机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2021年12月～2022年3月于柳州市人民医院生殖医学科ART治疗患者的卵泡液，根据生育力评估检查结果将患者分为卵巢功能正常组（Normal）和卵巢功能减退组（DOR），其中入组样本DOR组和对照组各9例，分为3批次重复采样，每批次收集3例患者卵泡液样本制备为均一化样本后进行外泌体的提取。纳入标准：①Normal组：年龄≤35岁，有排卵证据，基础激素水平正常，月经第 2～3天窦卵泡计数（antral follicle count,AFC）在7～20个之间，因输卵管梗阻或男方因素导致不孕；②DOR组：符合DOR诊断标准[2]，年龄≤35岁，有排卵证据，月经第 3 天AFC≤5～7个、抗苗勒管激素（AMH）＜0.5～1.1 ng/ml，基础促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）＞10 U/L，患者符合其中2项即可纳入研究。排除标准：①并发有其他女性内外科疾病如多囊卵巢综合症、高泌乳素血症和盆腔输卵管炎症等；②存在不良生活习惯（抽烟、酗酒等）和体重超重（体重指数BMI≥25 kg/m2）的患者。本研究已经获得柳州市人民医院医学伦理委员会批准同意[伦理号：2020（KY-E-18-01）]，患者均知情同意。

1.2 仪器与试剂 离心机（5424R，德国Eppendorf公司），IVF工作站（L126MP，丹麦K-systems公司），ZetaView纳米颗粒跟踪分析仪（ZetaView，德国Particle Metrix公司），荧光定量PCR仪（LightCycler 480 II，瑞士Roche公司），外泌体提取纯化试剂盒（UR52141，上海宇玫博科技有限公司），抗CD63鼠源单克隆一抗（ab193349，英国 Abcam公司），抗TSG101鼠源单克隆一抗（ab83，英国Abcam公司），卵泡液外泌体miRNA PCR芯片（wc-miRNA0043-H，上海沃吉基因科技有限公司），RNA提取试剂盒（RR037A，日本Takara公司），逆转录试剂盒（wc-SJH0031，上海沃吉基因科技有限公司），miRNA qPCR试剂盒（wc-SJH0004，上海沃吉基因科技有限公司）。

图1 卵泡液外泌体鉴定

1.3 方法

1.3.1 卵泡液收集：收集取卵手术过程抽取的卵泡液，选择澄清无血染卵泡液移入15ml 离心管中，室温条件下3 000 r/min离心10 min后将上清快速移入干净的离心管中，-20℃保存。

1.3.2 卵泡液外泌体的提取鉴定：使用外泌体提取纯化试剂盒提取纯化卵泡液外泌体，-80 ℃保存选取部分外泌体进行鉴定。外泌体鉴定使用电镜观察、蛋白免疫印迹（western blot,WB）和纳米粒子轨迹分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）方法鉴定：①透射电镜观察外泌体形态；②WB检测外泌体特异标记蛋白CD63和TSG101的表达；③NTA分析颗粒数量和直径大小分布。

1.3.3 RNA提取和逆转录：按照试剂盒说明书步骤提取外泌体总RNA。使用逆转录试剂盒对RNA进行miRNA的3’末端加Poly (A) 尾和逆转录，按照说明书要求配置10μl反应液。加尾和逆转录反应条件：42℃ 60min；酶失活：95℃ 3min。cDNA反应液-20℃保存备用，芯片检测和qRT-PCR实验前按需要稀释10～1 000倍后使用。

1.3.4 卵泡液外泌体miRNA PCR芯片检测：使用人源卵泡液外泌体miRNA PCR芯片（包含90条卵泡液外泌体miRNA引物，4个内参基因以及2个空白对照）进行检测。上样前芯片室温 2 000r/min离心20s，每块芯片需配制cDNA和qPCR mix混合液包括：miRNA PCR mix 510μl，cDNA 100μl，ddH2O 290μl和Rox染料20μl。按每孔加9μl混合液进行加样，加样后透明封板膜封板，室温 2 000 r/min离心20s后进行PCR检测，反应条件为：95℃ 预变性30 s（1个循环），扩增反应：95℃ 5s，60℃ 30s（40个循环）。每组样本进行3次生物学重复。根据检测结果剔除未表达或Ct值>35的数据，差异表达倍数（expressional foldchange,FC）的计算，设定｜log2FC｜>1.5且P<0.05作为筛选差异miRNA的标准。

1.3.5 差异表达miRNA qRT-PCR验证： qRT-PCR检测步骤按照miRNA qPCR试剂盒的操作说明书进行。let-7d-3p上游引物：5’-GCGCTATACGACCTG CTGC-3’，let-7e-5p上游引物：5’-CGCGTGAGGTAG GAGGTTGT-3’，miR-25-3p上游引物：5’-GCGCAT TGCACTTGTCTCG-3’，miR-30c-5p上游引物：5’-G CGCGTGTAAACATCCTACACT-3’，miR-483-3p上游引物：5’-CGCGTCACTCCTCTCCTCC-3’，通用下游引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；人U6启动子作为内参基因，上游引物：5’-CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，下游引物：5’-GCT TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。共进行至少3次生物学重复，每次重复至少3个平行检测孔。使用2-△△Ct法计算miRNA的相对表达量。

1.3.6 生物信息学分析：miRNA靶基因预测使用miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)，TargetScan (http://www.targetscan.org/)和miRbase (https://mirbase.org/) 数据库进行预测并取交集，剔除证据等级较低预测结果（miRNA与mRNA 3’-UTR有结合验证实验视为高证据等级）。使用DAVID在线数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）对差异miRNA的靶基因进行基因本体论(Gene Ontology，GO) 和京都基因与基因组百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。GO和KEGG分析使用Fisher 精确检验，假阳性率控制使用Bonferroni,Holm和 false discovery rate法对P值进行校正。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0对两组数据资料进行独立样本t检验比较分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵泡液外泌体鉴定 见图1。从卵泡液中提取的颗粒直径在30～150 nm之间，形态呈茶托状并表达外泌体特异蛋白CD63和TSG101。

2.2 筛选差异表达miRNA 从DOR和Normal两组外泌体中分别检测到50和64条miRNA表达，两组共表达48条，见图2A。共筛选出5条差异miRNA，其中4条表达下调：let-7d-3p，let-7e-5p，miR-25-3p和miR-30c-5p，1条表达上调：miR-483-3p，见图2B，相对表达量见表1。共表达miRNA聚类分析见图2C。

表1 差异表达miRNA的相对表达量

图2 卵泡液外泌体miRNA PCR阵列芯片表达分析

2.3 差异表达miRNA的qRT-PCR验证 见表2。与Normal组比较，DOR组let-7d-3p，let-7e-5p，miR-25-3p和miR-30c-5p表达降低，miR-483-3p的表达升高，差异具有统计学意义（均P<0.05），与芯片检测结果相符。

表2 差异表达miRNA在卵泡液外泌体中的表达（±s，n=3）

表2 差异表达miRNA在卵泡液外泌体中的表达（±s，n=3）

项目Normal组DOR组tP let-7d-3p1.08±0.480.14±0.063.1470.035 let-7e-5p1.03±0.290.24±0.114.4050.012 miR-25-3p1.04±0.380.17±0.023.9500.017 miR-30c-5p1.04±0.340.28±0.253.1470.035 miR-483-3p1.17±0.8433.97±17.74-3.1980.033

2.4 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID对差异表达miRNA的靶基因进行GO和KEGG通路富集分析。GO分析见图3A，结果显示靶基因主要定位于细胞核、细胞质基质以及细胞质，主要参与聚合酶II启动子转录的负调控DNA模板转录负调控以及翻译负调控等细胞生物学进程，主要参与信使RNA结合蛋白质结合及转录起始因子结合等分子功能。KEGG分析见图3B，靶基因主要富集于p53以及FoxO信号通路中，差异表达miRNA关键生物学功能信息见表3。

表3 差异表达miRNA关键生物学功能信息表

图3 GO和KEGG通路富集分析

3 讨论

在ART治疗过程中使用低剂量激素刺激和改变体外胚胎操作流程有益于DOR患者卵母细胞成熟和质量提高[3]，并且结合药物调节患者内分泌和子宫内膜容受性对提高患者妊娠率也有一定效果，然而患者的卵巢储备和卵泡发育整体质量仍与正常水平有不小的差距。研究者针对患者卵巢功能恢复进行了诸多尝试，例如线粒体注射、干细胞移植和外泌体注射等[4]，但这些治疗方法多数处于初步研究阶段且安全性有待商榷。此外，DOR是多因素诱发的病症，其发生涉及较多的基因和信号通路，因此深入研究DOR的发病机制和挖掘核心的分子靶标具有重大意义。

miRNA是一类功能广泛存在于机体且功能复杂的非编码小RNA，其中外泌体miRNA被认为是细胞间通讯的重要介质和疾病治疗的潜在候选标靶[5]，并且患者体液中的外泌体miRNA在常见疾病，诸如癌症、冠心病诊断中具有较高的临床诊断价值[6,7]。GHAFOURIAN等[8]认为外泌体miRNA在不孕不育症诊断和治疗同样具有较大潜力。卵巢细胞中miRNA表达模式发生改变时有可能导致卵巢功能异常发生，有研究指出DOR和正常卵巢颗粒细胞中miRNA表达模式存在明显差异，这种表达模式在DOR相关的细胞存活、增殖以及激素应答过程中起到关键作用[9]。亦有研究指出，卵泡液中外泌体miRNA表达变化是引起DOR患者卵巢储备和卵母细胞质量下降的潜在标靶[10]。本研究发现DOR患者卵泡液外泌体存在差异表达的miRNA，其中如let-7d-3p 和miR-30c-5p表达下调。有研究指出let-7d-3p 通过靶向结合Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）对卵巢颗粒细胞增殖的抑制作用参与调控卵巢功能[11]，而miR-30c-5p通过SOCS3/STAT3/VEGFA通路促进卵巢血管生成[12]。提示卵泡液外泌体可能通过转移let-7d-3p 和miR-30c-5p调控卵巢颗粒细胞增殖和血管生成的功能参与DOR的发生。

卵巢储备功能和卵泡发育受到多个分子信号通路的调节，研究证实野生型p53诱导磷酸酶（wildtype P53-induced phosphatase 1，WIP1）的低表达会促进WIP1-p53-Bax信号通路介导的细胞凋亡从而加速卵巢衰老[13]。另一项研究证明抑制AKTFOXO3a以及p-ATM/γH2AX/CHK2/p53信号通路可以改善卵巢储备并减少卵母细胞的凋亡[14]。亦有报道指出，FOXO1-TP53INP1信号通路的激活会引起卵巢颗粒细胞发生G0/G1期阻滞从而影响卵泡发育[15]。本研究生物信息学分析结果显示差异表达miRNA靶基因主要富集在p53和FoxO信号通路上，提示外泌体中差异表达miRNA会影响受体细胞中p53和FoxO信号通路的调节，从而引起DOR患者卵泡储备和发育的异常。此外，本研究还发现卵泡液外泌体中miR-483-3p表达上调，证据表明miR-483-3p能够靶向抑制甲基化转移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）介导的RNA N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰[16]，抑制METTL 3介导的mRNA m6A修饰作用会阻碍卵泡发育和卵母细胞成熟[17]。这提示卵泡液外泌体miR-483-3p对METTL 3表达的抑制作用导致受体细胞中mRNA m6A修饰水平下降可能是引起DOR患者卵母细胞质量下降的潜在分子机制。

综上，我们通过miRNA PCR阵列芯片法发现DOR患者卵泡液外泌体中存在差异表达的miRNA，其可能通过调控细胞增殖/凋亡相关信号通路和RNA m6A修饰水平参与卵巢功能减退的发生。本研究结果有望为DOR诊治和发生机制提供新的靶位，后续我们将进一步验证差异表达miRNA的临床诊断价值及作用机制。