肺腺癌组织中MCM4的表达及其与预后、免疫微环境的相关性分析

苗 毅，杨淑梅，王 晶，武润苗，孙皎琳，吴军芳

（陕西省人民医院 a.呼吸与危重症医学科；b.检验科，西安 710068）

全球癌症统计报告(GLOBOCAN 2020)数据显示，肺癌新发病例数高达220万，约占总新发癌症病例数的11.4%，位列第二；死亡病例数占所有癌症死亡病例数的18%，位列第一[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，约占80%～85%[2-3]；肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）作为NSCLC的主要亚型（约占40%～45%），将被纳入本次研究。随着医疗手段的不断进步，部分患者的预后水平已得到较大提高，但是能够持续性获益的患者仍是少数。LUAD新型靶点的研究有望为患者提供新的诊疗方案，提高疗效，改善预后。

微小染色体维持蛋白4（minichromosome maintenance proteins 4，MCM4）是一个高度保守的蛋白编码基因，属于MCM蛋白家族，主要参与调控真核生物的DNA复制起始[4-5]。最新研究发现，MCM4在包括黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺导管腺癌等多种癌症中异常表达且具有作为其预后标志物的潜力[6-11]。除此之外，有研究发现MCM4在NSCLC中高表达，且高表达MCM4患者的生存期明显缩短[12-14]。本研究通过结合临床样本和多种公共数据库分析，探究LUAD癌组织中MCM4的表达及其与预后、免疫微环境的相关性，旨在为LUAD的临床诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2021年1～7月在陕西省人民医院行手术切除治疗的4例LUAD患者，其中男性2例，女性2例。患者手术前均未接受任何治疗，且均无其他恶性肿瘤。术中采集LUAD癌组织以及距离癌组织2 cm以上癌旁组织，后者作为癌组织的对照。患者对本研究知情，并签署知情同意书。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 RNA提取、定量、纯度检测和完整性检测试剂盒RNeasy Plus Universal Kits（Qiagen,德国），QubitTMRNA HS检测试剂盒（美国赛默飞世尔科学公司），Take3（BioTek,美国），Qseq100 Bio-Fragment Analyzer（Bioptic,中国）的RNA Cartridge。建库试剂盒VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina（Vazyme,中国），测序仪器Illumina Hiseq 2000（Illumina，美国）。

1.3 方法

1.3.1 组织RNA提取、建库和测序及分析：利用RNeasy Plus Universal Kits在新鲜的癌组织和癌旁组织中提取总RNA，利用QubitTMRNA HS检测试剂盒定量提取的RNA浓度。分别用Take3和Qseq100 Bio-Fragment Analyzer的RNA Cartridge检测RNA的纯度和完整性。应用VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina构建RNA-seq文库并在Illumina Hiseq 2000进行双端100bp测序。采用TrimGalore-0.6.0（https:// MCM4www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）去除原始数据中的测序接头和低质量reads。Kallisto v.0.46.2用于统计基因的TPM（transcript per million）值，并用Mann-WhitneyU检验比较LUAD癌组织和癌旁组织中MCM4的表达差异。

1.3.2 TCGA-LUAD数据分析：使用TCGA-LUAD数据（https://xenabrowser.net/）验证LUAD癌组织和癌旁组织中MCM4的表达差异。Gene Expression Profiling Interactive Analysis2（GEPIA2,http://gepia2.cancer-pku.cn/）数据库用于探究MCM4及其共表达基因和LUAD患者总生存期（OS）及无病生存期（DFS）的相关性，并绘制生存曲线。

1.3.3 LUAD中MCM4的共表达、功能富集及调控分析：采用LinkedOmics（http://www.linkedomics.org/login.php）数据库的Pearson相关分析模块鉴定LUAD中MCM4的共表达基因，并通过 STRING（https://string-db.org/）构建蛋白质互作网络。采用LinkInterpreter中的Gene set enrichment analysis（GSEA）模块对MCM4及其共表达基因进行GO_BP富集分析、KEGG pathway富集分析、miRNA-target富集分析和转录因子-target富集分析。过滤条件设置为FDR（false discovery rate）、最小基因数为10、模拟次数为1 000次。

1.3.4 MCM4与LUAD免疫微环境的相关性分析：采用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）数据库分析MCM4与LUAD肿瘤免疫微环境的相关性，包括肿瘤纯度和6种免疫细胞（B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）。

1.4 统计学分析 采用R 4.1.2软件进行数据分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示。Mann-WhitneyU检验比较LUAD癌组织和癌旁组织中MCM4的表达差异；Log-rank检验比较两组间的累积生存率；单因素和多因素COX回归分析LUAD患者预后的影响因素；森林图（forestplot包）在R中绘制。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LUAD癌组织和癌旁组织中MCM4表达水平的比较 在实验样本中，LUAD癌组织MCM4的表达量（6.50±0.86）高于癌旁组织（4.22±0.66），差异有统计学意义（U=16，P=0.029）。TCGA-LUAD数据分析显示与实验样本相似的结果，LUAD癌组织MCM4的表达量（3.63±0.92）高于癌旁组织（1.90±0.28），差异有统计学意义（U=30 355，P<0.001）。

2.2 LUAD中MCM4表达与其生存期的相关性 见图1。生存分析显示，MCM4高表达LUAD患者OS 200个月的累积生存率是8.79%（21/239），低于MCM4低表达患者的28.87%（69/239），差异有统计学意义（HR=1.7，P=0.001），见图1A。MCM4高表达LUAD患者DFS 200个月的累积生存率是19.25%（46/239），低于MCM4低表达患者的36.82%（88/239），差异有统计学意义（HR=1.4，P=0.046），见图1B。

图1 MCM4表达情况LUAD患者生存曲线

2.3 LUAD中MCM4的共表达及功能富集 见图2。共表达分析显示，LUAD中与MCM4呈正相关的基因有4 868个，负相关的基因有5 892个，见图2A（FDR<0.01）。与MCM4呈正相关的前20个基因中，MCM2，MCM10，GINS4，CDC6和ORC1与MCM4的相互作用最强，见图2B。生存分析显示，与MCM4呈正相关的前20个基因中，19个基因表达量升高与LUAD的OS短有关，见图2C（均P<0.05）；3个基因表达量升高与LUAD的DFS短有关，见图2D（均P<0.05）。GO-BP富集分析显示，MCM4共表达基因主要参与染色体分离、DNA复制、细胞周期检查点等通路 (均FDR<0.05)。KEGG富集分析显示，MCM4的共表达基因主要参与细胞周期、DNA复制、P53信号通路和错配修复等通路 (均FDR<0.05)。

图2 LUAD中MCM4的共表达分析

2.4 LUAD中MCM4的调控作用 调控分析显示，LUAD中与MCM4及其共表达基因相关的miRNA靶点为“TACTTGA，MIR-26A，MIR-26B”，“CAGCAGG，MIR-370”，“ATCATGA，MIR-433”和“AGGGCCA，MIR-328”（均P<0.05）。LUAD中与MCM4及其共表达基因相关性最强的前5个转录因子靶点为“V$E2F_Q4”，“V$E2F_Q6”，“V$E2F1_Q6”，“V$E2F4DP1_01”和“V$E2F_02”（均FDR=0）。

2.5 LUAD中MCM4表达与肿瘤免疫微环境的相关性 见图3。TIMER分析结果显示，LUAD中MCM4表达与中性粒细胞的浸润水平（Neutrophil）呈正相关（partial.cor=0.14，P=0.002）；与B细胞的浸润水平呈负相关（partial.cor=-0.152，P<0.001）；与肿瘤纯度、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞以及树突细胞的浸润水平无相关性（均P>0.05）。

图3 MCM4表达水平与LUAD肿瘤免疫细胞浸润的相关性

2.6 影响LUAD患者预后的COX回归分析 见图4。单因素COX回归分析显示，MCM4的HR和95%的置信区间为1.238和1.086～1.411，见图4A。多因素COX回归分析显示，MCM4的HR和95%的置信区间为1.227和1.051～1.431，见图4B。综上，MCM4是影响LUAD患者预后的独立因子（均P<0.05）。

图4 影响LUAD患者预后的危险因素

3 讨论

微小染色体维持蛋白4（MCM4）是一个高度保守的蛋白编码基因，属于MCM蛋白家族。通过结合实验样本和公共数据库分析，我们发现MCM4在LUAD癌组织中表达量升高，且其表达与LUAD的OS及DFS有关。这些发现与之前报道中的发现一致[13-15]。

通过共表达网络和功能富集分析发现，MCM4与多种蛋白存在相互作用，且这些蛋白质主要参与肿瘤发生相关通路。LUAD中与MCM4正相关的前20个基因中有3个基因的表达水平升高同时与OS和DFS短有关，它们分别是BUB1B,EXO1和CHEK1。BUB1B基因编码一种与纺锤体检查点功能有关的激酶，有研究发现纺锤体检查点功能受损出现在多种癌症中。除此之外，有研究报道BUB1B与多种癌症的发生发展有关，如肝细胞癌、前列腺癌、肺腺癌等[16-18]。CHEN[19]等通过meta分析发现BUB1B是LUAD患者不良预后的重要标志物。EXO1（核酸外切酶1）是Rad2核酸外切酶的家族成员之一。有研究报道EXO1在多个癌症中异常表达，如胃食管癌、乳腺癌、宫颈癌等[20-22]。ZHOU等[23]发现EXO1是LUAD潜在的预后标志物，并报道其与LUAD的免疫细胞浸润有关。CHEK1（检查点激酶1）基因编码的蛋白属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。研究报道CHEK1在乳腺癌、卵巢癌等癌症中异常表达[24-25]。综上提示，BUB1B,EXO1和CHEK1可能是LUAD的新型分子标志物，其功能仍需进一步研究探讨。

通过调控分析发现，在LUAD中E2F转录因子家族是MCM4失调的主要转录因子。E2F家族在决定细胞何时分裂方面起着关键作用，肿瘤中E2F表达和/或E2F靶表达升高与预后不良有关[26]。例如，E2Fs在乳腺癌、肺癌、前列腺癌的癌组织中均高表达[27-28]；E2F1与NSCLC的不良预后有关[29]；E2F2是肺癌的肿瘤激活因子和独立预后标志物[30]。MCM4可能是通过E2F调控因子影响LUAD患者的预后，后续需要进一步探究。

多研究发现肿瘤免疫微环境与肿瘤的发生发展以及预后水平密切相关，探究MCM4与LUAD肿瘤免疫细胞浸润的相关性具有一定价值。结果显示MCM4与中性粒细胞呈正相关，与B细胞浸润呈负相关。新近研究发现中性粒细胞可以通过释放活性氧导致DNA的碱基突变，促进肿瘤发生[31]。此外，中性粒细胞还可与肿瘤免疫微环境中的其他免疫细胞发生相互作用，如中性粒细胞通过CXCR4-CXCL12配受体相互作用分泌IL-10，从而抑制细胞毒性T细胞的功能，促进肿瘤发生[31]。识别MCM4高表达群体中的“immune-hot”亚群患者，并对其进行有针对性的免疫治疗，可能会提高这部分患者的生存率。此方面的临床意义值得探索和研究。

综上所述，LUAD癌组织中MCM4表达升高，与预后及免疫微环境显著相关，可作为LUAD患者不良预后评估的分子标志物。但本研究仍存在一定的局限性，如本文中部分结果是基于公共数据库展开，故而缺乏相关的分子实验验证；同时受临床样本量的限制，可能导致分析统计的误差，后续需要扩大样本展开进一步研究。