不同严重程度肺炎支原体肺炎患儿肺部NLRP3信号通路的变化及其临床价值*

彭力，钟礼立，黄寒，林琳，丁小芳，陈敏，林小娟

[湖南师范大学附属第一医院（湖南省人民医院） 儿童呼吸病学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410005]

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）是社区获得性肺炎常见致病菌之一[1]，主要致病机制包括直接感染、间接感染和免疫损伤[2]。近年来重症或难治性儿童肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）患儿较多，病死率可达3%～5%[3]，然而该病发病机制目前仍未完全阐明[4]。

自噬是人类进行稳态维持的一种机制，将胞内损伤的蛋白质、细胞器及侵入病原菌经溶酶体进行降解，具有抵抗病原菌作用[5]。近来研究显示MP侵入呼吸道上皮细胞后可引发机体自噬，但目前自噬相关信号通路在儿童MPP研究较少。基于此，本研究回顾性分析湖南省人民医院MPP患儿临床资料，评估NOD样受体蛋白3（NOD like receptor protein 3,NLRP3）信号通路相关蛋白在不同严重程度MPP中的变化，为MPP发病机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年4月—2022年10月湖南省人民医院儿童医学中心住院，行纤维支气管镜肺泡灌洗治疗的90例MPP患儿作为MPP组。其中男性50例，女性40例；年龄2～11岁，平均（5.6±2.1）岁。MPP符合《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015年版）》[6]诊断标准，即临床表现和影像学具有肺炎改变，结合病原学检查考虑MP急性感染：MP-免疫球蛋白（Immunoglobulin M,IgM）≥ 1∶160，或双份血清（间隔2周）恢复期抗体滴度上升4倍或下降至原来的1/4，或MP-DNA阳性。根据病情将90例经纤支镜肺泡灌洗的MPP患儿分为轻度组和重度组，在诊断MPP基础上，至少存在以下特征之一为重度组：拒食或有脱水征；意识障碍；呼吸频率增快（根据不同年龄判定）；紫绀；呼吸困难（呻吟、鼻翼扇动或三凹征）；多肺叶或≥ 2/3肺受累；胸腔积液；脉搏血氧饱和度≤ 0.92；合并肺外并发症等[7]。其余患儿作为轻度组。轻度组患儿26例，其中男性17例，女性9例。重度组患儿64例，其中男性33例，女性31例。选取同期本院行异物取出术后复查的10例儿童作为对照组，其中男性5例，女性5例，无发热、明显咳嗽等临床症状，无肺外并发症等情况。

1.2 方法

回顾性分析MPP患儿性别、年龄、住院时间等基本资料，以及住院后的临床资料和实验室检查指标[白细胞计数（white blood cell count,WBC）、血小板计数（platelet count,PLT）、降钙素原（Procaicltonin,PCT）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、丙氨酸转移酶（alanine transaminase,ALT）、IgA、IgG、IgM、D二聚体]、MP拷贝数及肺外并发症。患儿均于入院24 h内留取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）标本，采用荧光定量聚合酶链反应行MP-DNA检测，采用酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）检测受试者BALF标本自噬相关蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,MAP1LC3B）、核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）和NLRP3水平。操作方法严格按照产品说明书进行，批内及批间分析变异系数分别＜ 10%，所有样本设3个复孔。取对照组的肺泡灌洗液标本行MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平检测。本研究经医院医学伦理委员会审批通过（No：2023-17）。

1.3 MPP患儿获取纤维支气管镜肺泡灌洗液步骤

纤维支气管镜先端插入病变管嵌入管腔内（灌洗部位多选择病变严重肺段，病变范围比较广泛者则选右肺中叶，小婴儿选择右下叶），以37 ℃生理盐水（体重＜ 20 kg者，每次灌洗量1 mL/kg，体重≥ 20 kg者，每次灌洗量20 mL/kg）进行支气管肺泡灌洗3次。随即以负压13.3～20 kPa（100～150 mmHg）进行抽吸以获取灌洗液标本，置入灭菌痰液收集器。回收率＞ 40%、无大气道分泌物混入，红细胞＜ 20%视为合格标本。及时处理标本后置于-80 ℃冰箱冷冻保存以备检查。

1.4 MPP患儿行纤维支气管镜检查的指征

1.4.1 适应证 胸部X射线或CT检查示肺不张或含气不良，或符合难治性MPP诊断标准[6]的患儿。

1.4.2 禁忌证 严重心肺功能减退、心律失常、活动性大咯血，严重的出血性疾病、凝血功能损伤、严重的肺动脉高压及其他可能诱发大咯血的疾病，严重营养不良，不能耐受手术等均为相对禁忌证。发热患儿行纤维支气管镜术前需将体温降至38 ℃以下。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，比较用t检验或秩和检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPP组与对照组MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平比较

MPP组与对照组MAP1LC3B、NF-κB和NLRP水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），对照组低于MPP组。见表1。

表1 MPP组与对照组MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平比较 （x±s）

2.2 轻度组与重度组临床资料比较

轻度组与重度组性别构成、发病年龄、WBC、PLT、PCT、ALT、IgG、IgM、MP拷贝数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。轻度组与重度组发热时间、住院时间、影像学肺实变、肺外并发症、胸腔积液、CRP、LDH、D二聚体、IgA、MAP1LC3B、NF-κB、NLRP3表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；重度组发热时间和住院时间较轻度组长，CRP、LDH、D二聚体、IgA、MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3表达量较轻度组高。见表2。

表2 轻度组与重度组临床资料比较

2.3 MAP1LC3B与NF-KB、NLRP3水平的相关性分析

Spearman相关性分析显示，MAP1LC3B与NFκB水平（rs=0.510，P=0.020）、NLRP3 水平（rs=0.610，P=0.006）均呈正相关。见图1、2。

图1 MAP1LC3B与NF-KB水平的相关性分析

图2 MAP1LC3B与NLRP3水平的相关性分析

3 讨论

本研究结果提示，MPP重度组热程较轻度组长，说明患儿炎症持续存在，未得到有效控制，而高炎症反应状态下会导致机体出现持续高热的状况，最终导致疾病进展[8]。本研究结果发现，重度组CRP、LDH表达量较轻度组高。CRP、LDH均为炎症指标[9]，在重度组明显升高表明该组患儿感染MP后发生更强烈的炎症反应。本研究结果还显示，重度组D二聚体平均水平高于轻度组,与既往研究一致[10]。另外，IgA水平在重度组较轻度组明显升高，可能与重度发生更为强烈的免疫反应有关。

MP与自噬相关。目前最新研究发现，肺炎支原体可通过Toll样受体4和自噬依赖的途径诱导小鼠巨噬细胞产生炎症反应[11]。肺炎支原体社区获得性呼吸窘迫综合征毒素也可激活NLRP3炎症小体，诱导THP-1细胞自噬[12]。另有鸡毒支原体可能通过Toll样受体2激活NF-κB信号通路诱导巨噬细胞自噬[11,13]。另有研究发现，绵羊肺炎支原体可诱导肺脏上皮细胞和巨噬细胞自噬[12]。MAP1LC3B参与自噬体形成，是自噬信号通路中不可缺少的蛋白之一，是判断反应机体自噬严重程度的重要指标[14]。本研究结果显示，MPP组MAP1LC3B水平较对照组显著升高，且重度组MAP1LC3B水平较轻度组高，表明自噬参与MPP发病，且与MPP严重程度相关，与文献研究显示自噬相关蛋白与疾病严重程度相关结论一致[15]。

NLRP3炎症小体是目前研究最广泛、最明确的一种炎症反应关键的调控点，且与肺部感染疾病关系密切[16]。报道表明在呼吸机相关肺损伤中，肺泡巨噬细胞中自噬的激活通过NLRP3炎症小体信号传导介导了机械通气期间的早期肺部炎症[17]。自噬还可以直接调节核转录因子NF-κB，从而调控相关炎症反应[13]，而NF-κB通路激活NLRP3炎症小体[18]。因此笔者推测，自噬通过调节NF-κB介导了NLRP3炎症小体的激活，参与支原体肺炎的炎症反应的发生。本研究结果发现，MPP组NF-κB、NLRP3表达量较对照组高，重度组NF-κB、NLRP3水平较轻度组高，进一步相关性分析提示MAP1LC3B与NF-κB、NLRP3呈正相关，提示自噬-NLRP3信号通路相关蛋白及细胞因子参与MPP的致病机制，且与疾病严重程度相关，临床中在疾病早期通过对自噬-NLRP3信号通路相关蛋白及细胞因子检测可为MPP的病情预测提供依据。

综上所述，自噬-NLRP3通路信号参与MPP的发生、发展，以自噬-NLRP3通路作为调控MPP炎症反应的靶点，以期为肺炎支原体感染所致肺炎支原体肺炎的早期防治提供理论依据。