膀胱癌组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表达及与患者肿瘤特征、预后的相关性分析*

姬文莉，王翠翠，林珍珍，张焕

（新疆医科大学附属肿瘤医院 病理科，新疆 乌鲁木齐 830011）

膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，可引起膀胱纤维化，降低膀胱容量，出现尿液反流，造成肾积水和肾脏炎症，使患者出现尿急、尿痛等排尿系统损害，甚至危及患者生命[1]。膀胱癌恶性程度高、预后差且早期诊断率较低，故积极探索与疾病进展、癌细胞转移相关的蛋白，或许能够为预后评估提供新的思路，并为临床治疗提供新的靶点。Beclin1蛋白是酵母自噬基因Atg6的同源基因，作为与自噬相关的肿瘤抑制基因，其具有抑制肿瘤的发生与进展、诱导凋亡、自噬等功能，与多种恶性肿瘤的抗肿瘤治疗相关[2-3]。微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白也属于自噬相关基因之一，参与自噬体形成，在自噬的溶酶体降解过程中发挥抑癌作用[4-5]。本研究观察膀胱癌组织中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达状况，并分析两者与预后的相关性，旨在为膀胱癌的治疗及预后评估提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月—2021年8月新疆医科大学附属肿瘤医院病理资料完整的110例膀胱癌患者。其中，男性79例，女性31例；年龄54～78岁，平均（65.49±6.13）岁；体质量指数20～29 kg/m2，平均（25.82±2.16）kg/m2；白细胞计数4.2～11.5×109/L，平均（7.52±2.03）×109/L；血红蛋白89～128 g/L，平均（116.42±7.18）g/L；合并糖尿病14例，高血压42例。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①符合《临床肿瘤学》[6]中膀胱癌诊断标准；②经病理组织学检查确诊；③预计生存期＞6个月；④接受根治性切除治疗；⑤患者或家属签署知情同意书。排除标准：①入组前接受放射治疗、化学治疗或其他辅助治疗；②长期服用免疫抑制剂；③伴有其他恶性肿瘤；④合并血液系统疾病或免疫系统功能障碍；⑤膀胱癌以外的因素导致死亡。

1.3 方法

1.3.1 膀胱癌组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白检测 采集患者癌组织、癌旁组织样本，生理盐水冲洗，置于10%甲醛固定24 h，取出用酒精洗涤待测。采用分支DNA-液相芯片法检测样本中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白，具体操作：在待测样本中加入一定量裂解液，置于55～58 ℃环境中裂解120 min，移至孵育板上，加入缓冲液、探针-微球、延伸探针置于55 ℃环境中震荡孵育过夜；第2天将孵育板静置于磁力架上60 s，使磁性微球沉积至底部，去除上清液，加入洗涤液，震荡洗涤60 s，再次置于磁力架上静置60 s，去除上清液，反复3次；加入标记延伸探针、探针，50 ℃环境下震荡反应60 min；再次加入洗涤液，震荡洗涤60 s，磁力架上静置60 s，去除上清液，洗涤2次；加入藻红蛋白，50 ℃环境下震荡反应30 min，磁力架上静置60 s，去除上清液，洗涤2次；加入洗涤液震荡5 min，采用Luminex阅读仪读取数据，获得检验结果。结果判读：Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达水平≥75%视为高表达，65%～＜ 75%视为中偏高表达，40%～＜ 65%视为中表达，25%～＜ 40%视为中偏低表达，＜ 25%视为低表达。将高表达、中偏高表达作为高表达，中表达、中偏低表达、低表达作为中低表达。

1.3.2 病理参数 详细记录膀胱癌患者病理参数，包括性别、年龄（＜ 60岁、≥ 60岁）、肿瘤直径（＜ 3 cm、≥ 3 cm）、血管侵犯（是、否）、组织学分级（高级别、低级别）、临床分期（Ta～T1、T2～T4）、浸润性（是、否）、淋巴结转移（是、否）。

1.3.3 预后评估 随访1年，将肿瘤病灶完全缓解或部分缓解且持续生存的患者视为预后良好；将肿瘤复发、肿瘤病灶稳定、进展、出现新发病灶或病死的患者视为预后不良。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Phi法；影响因素的分析采用多因素逐步Logistic回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织与癌旁组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达率比较

膀胱癌组织与癌旁组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表达率较癌旁组织低，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表达率较癌旁组织高。见表1。

表1 膀胱癌组织与癌旁组织Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达比较 [n =110，例（%）]

2.2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表达率比较

有49例膀胱癌患者Beclin1蛋白高表达。不同组织学分级、临床分期、预后和是否浸润性、淋巴结转移患者Beclin1蛋白高表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），高组织学分级、T2～T4分期、浸润性、淋巴结转移、预后不良的膀胱癌患者低于低组织学分级、Ta～T1分期、非浸润性、无淋巴结转移、预后良好的患者。不同性别、年龄、肿瘤直径、血管侵犯的膀胱癌患者Beclin1蛋白表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表达率比较 例（%）

2.3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表达率比较

36例膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表达。不同组织学分级、临床分期、预后和是否浸润性、淋巴结转移患者LC3Ⅱ蛋白高表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），高组织学分级、T2～T4分期、浸润性、淋巴结转移、预后不良的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表达率低于低组织学分级、Ta～T1分期、非浸润性、无淋巴结转移、预后良好的患者。不同性别、年龄、肿瘤直径、血管侵犯的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表达率比较 例（%）

2.4 膀胱癌组织中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达与预后的相关性

经Phi系数相关性分析，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白与预后不良均呈负相关（Phi= -0.277和-0.222，P=0.004和0.020）。

2.5 影响膀胱癌患者预后的多因素逐步Logistic回归分析

将患者预后作为因变量（预后良好= 0，预后不良= 1），Beclin1蛋白表达（中低表达= 0，高表达= 1）和LC3Ⅱ蛋白表达（中低表达= 0，高表达= 1）为自变量，采用向前逐步法，进行多因素逐步Logistic回归分析。结果显示：Beclin1高表达[=3.892（95% CI：1.504，10.072）]、LC3Ⅱ蛋白中低表达[=3.358（95% CI：1.165，9.677）]是预后不良的危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响膀胱癌患者预后的多因素逐步Logistic回归分析参数

3 讨论

自噬主要指通过溶酶体途径降解一些细胞内源性底物和细胞内大分子物质的生理过程，是机体对外界不良刺激的主动防卫策略，也是一种细胞程序性死亡形式，是真核生物普遍存在的生理过程之一。近年来研究发现，自噬与多种恶性肿瘤密切相关，参与肿瘤的发生、细胞死亡、进展等病理过程[7]。在前列腺癌、肝癌、甲状腺癌、卵巢癌等多种癌症中均发现自噬相关蛋白缺失或活性下调，并对患者预后及生存产生重要影响[8-9]。但目前，有关自噬在膀胱癌中的潜在分子机制尚无明确定论。

Beclin1基因位于染色体17q21，是具有450个氨基酸序列、12个外显因子的蛋白质，由3个结构域组成，N端是与抗凋亡家族成员BCL-w、BCL-xl、BCL-2等结合的结构域，能够破坏肿瘤的抗凋亡能力；中间为螺旋结构域，可结合紫外线辐射抵抗的相关蛋白，形成自噬膜并对肿瘤进展产生抑制作用；C端与细胞膜相连，为进化保守结构域，可与Vps34相结合，启动自噬达到抑制肿瘤的作用[10-11]。ZHANG等[12]研究指出，Beclin1过表达能够抑制食管癌细胞增殖并诱导自噬。ZHANG等[13]研究表明，靶向ARBeclin1复合物能够有效抑制去势抵抗性前列腺癌的生长。本研究结果发现，膀胱癌组织中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表达率低于癌旁组织，表明Beclin1蛋白表达减少与肿瘤生长相对应；进一步分析其与膀胱癌患者预后的关系，结果显示，Beclin1与患者预后不良呈负相关，Beclin1蛋白中低表达是预后不良的危险因素。细胞自噬凋亡能够消除衰老细胞，维持生物体动态平衡。自噬基因Beclin1结合其配体能够调节自噬，诱导癌细胞自噬性凋亡；而自噬基因Beclin1表达缺失时，肿瘤则可能逃避自噬性死亡。Beclin1作为促凋亡分子能够抑制BCL-w、BCLxl、BCL-2等抗凋亡因子活性，并增强半胱氨酸蛋白酶活性，增强顺铂、白桦脂酸、甲氨蝶呤等抗癌药物功效，诱导肿瘤细胞凋亡[14]。有研究认为，Beclin1能够上调去泛素化酶人泛素特异性肽酶13（USP13）、USP10、USP2活性，增强抑癌基因活性，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤进展[15]。而Beclin1表达缺失或降低则可能促进肿瘤细胞周期相关蛋白表达、促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤细胞增殖、转移和新血管成熟，导致肿瘤进展，对患者预后产生不利影响。

LC3与酵母自噬基因Atg8约有30%的氨基酸同源，LC3在细胞内部主要定位于自噬泡表面和前自噬泡。LC3可分为Ⅰ型和Ⅱ型，未出现自噬时，细胞胞质内常规表达Ⅰ型LC3，出现自噬时，LC3Ⅰ可与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺相结合，形成LC3Ⅱ，并始终结合在自噬体膜上，是标志性自噬基因[16]。HUANG等[17]研究指出，LC3乙酰haul水平降低可促进子宫内膜癌细胞增殖。吴筱蔓等[18]观察喉癌组织及正常组织中LC3表达发现，与正常组织比较，喉癌组织中LC3阴性表达率更高，LC3表达阴性可能是影响喉癌患者预后生存的独立危险因素。本研究结果发现，膀胱癌组织中LC3Ⅱ蛋白高表达率低于癌旁组织，与患者预后密切相关，LC3Ⅱ蛋白中低表达是预后不良的危险因素。研究指出，自噬的自我降解过程广泛存在于真核细胞中，其在细胞废物清除、生长发育、重建等过程中发挥重要作用[19]。而作为自噬溶酶体最基本的组成成分，LC3表达与自噬活性相关，当机体发生自噬时，细胞内LC3含量明显增加。LC3表达降低时，细胞自噬能力也随之降低，恶性细胞增殖速度加快，机体不能及时、有效地清除损伤、变异的细胞，则可能促进肿瘤的发生[20]。此外，LC3表达下调或缺失还可能对多种癌基因产生激活作用，诱导癌细胞生长，加重病情进展，影响患者预后。

综上所述，膀胱癌组织中Beclin1、LC3Ⅱ表达与预后密切相关，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表达是预后不良的危险因素，临床应密切关注膀胱癌患者癌组织中两种蛋白表达情况，并采取对应干预措施，以改善患者预后。