分子印迹技术在分离天然活性成分中的应用研究进展

管勤昊, 闫林林, 汤丽华, 徐 曼, 张亮亮, 黄立新

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042; 2.华侨大学 先进碳转化技术研究院,福建 厦门 361021)

天然活性物质是一种广泛存在于动植物及海洋生物体内的生物因子,根据结构及功能差异,主要可分为多酚类、黄酮类和生物碱类等[1],大多数天然活性物质拥有调节血糖血脂、抑制肿瘤生长、抗氧化等多种生理功效,在食品、医疗领域具有较高价值[2-4]。目前,针对天然活性物质的分离方法主要包括溶剂提取法、沉淀法和结晶法等传统分离方法,以及近年来新发展的大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、高速逆流色谱法、分子印迹法等新兴分离方法[5-8]。分子印迹技术(MIT),也称作分子模板技术,通常被描述为根据目标“分子模板”定制具有特殊结构“分子识别器”的方法,其可以针对目标分子进行专一定制从而实现特异性识别、分离和纯化目标分子[9-10]。目前,分子印迹技术已广泛应用于化学分析[11-12]、递送体系[13-14]、食品安全[15-16]、生物技术[17]等领域。由于分子印迹技术具有特异性识别特性,与天然活性物质的分离目的不谋而合,将其应用于天然活性物质的分离具有极高可行性。近年来,分子印迹技术应用于天然活性物质的研究受到了越来越多科研工作者的青睐并取得了显著成效。因此,本文对分子印迹技术进行了概述,同时对其在天然活性物质分离方向的应用进行了论述与展望,旨在为今后相关研究提供参考。

1 分子印迹技术概论

1.1 基本原理

分子印迹技术是一种合成具有模板分子特异性识别位点聚合物的技术[18],其本质是以给定目标分子为模板,针对其设计分子印迹聚合物(MIPs),从而实现特异性识别与纯化的过程[9]。具体作用过程如图1所示。首先,根据模板分子特性选择与之互补的功能单体并使二者通过共价、非共价或金属配位等方式结合,形成模板-单体复合物;而后将功能单体与交联剂进行聚合,以产生固定形态,最后将模板-单体复合物中模板分子进行洗脱,从而得到分子印迹聚合物。该聚合物内存在可以与模板分子发生多点位相互作用的空穴,在空间结构等方面与模板分子相匹配,从而实现对模板分子的特异性识别[19-21]。根据模板分子与功能单体之间相互作用类型,可将制备分子印迹聚合物方法分为共价作用、非共价作用、半共价作用和金属配位作用等[22-23]。

1.2 分子印迹技术作用方式分类

1.2.1共价作用 共价作用法是由Wulff等创立发展起来的,主要印迹分子包括席夫碱、缩酮、硼酸酯等[24-26]。该方法中,模板分子和功能单体以共价键形式连接并进一步交联聚合生成聚合物,随后在特定化学条件下打开共价键脱去模板分子生成分子印迹聚合物[27]。该方法生成的模板-单体复合物十分稳定,具有分布均匀且强度较大的结合位点,但可供共价作用使用的可逆共价反应仅仅局限于少数化学反应,使得该方法具有较大局限性。

1.2.2非共价作用 非共价作用法与共价作用法主要区别在于模板分子与功能单体结合过程中作用力的不同。非共价作用是指模板分子与功能单体之间主要通过氢键、静电相互作用、范德华力等非共价作用自组装形成模板-单体复合物,而后通过交联、洗脱得到分子印迹聚合物[28-29]。相较于共价作用,该方法模板分子易洗脱,但特异性识别能力相对较弱[30-31]。

1.2.3半共价作用 半共价作用法实质上是将共价作用与非共价作用相互结合而成的方法。模板分子与多种功能单体同时通过共价作用与非共价作用连接形成模板-单体复合物,经交联、洗脱得到分子印迹聚合物。该方法较共价作用与非共价作用更加简单便捷,但需选择多种针对模板分子的功能单体,较为繁琐[21,32]。

1.2.4金属配位作用 金属配位作用具有高度立体选择性,并且在配位键结合与断裂过程中较为温和。当前已用于分子印迹技术的金属离子主要有Zn2+、Cu2+、Ni+等[33-34]。通过金属离子配位进行分子印迹是一种不同于传统分子印迹的方式,其主要区别在于该方法除需要模板分子、功能单体、交联剂外,还需要向体系中加入金属离子作为连接模板分子与功能单体的桥梁。而金属配位作用作为一种相对较强且可以稳定存在于水或醇溶液中的作用力,可以成为取代其他非共价相互作用的途径之一。目前,金属配位分子印迹聚合物在极性溶剂与质子溶剂中均表现出良好的印迹效率,且以Cu2+与Fe3+为代表的金属离子在进行配位分子印迹的同时还可以形成催化中心,进一步拓展了分子印迹聚合物的用途。该方法常用于分离多肽、蛋白及天然活性成分,在生物、中药学等领域具有广泛前景。

1.3 常用原料

分子印迹过程中,原料包括模板分子、功能单体、交联剂、引发剂和溶剂等。按研究目的选择模板分子,而后根据模板分子结构特点寻找可能与其相结合的功能单体,如4-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸和丙烯酰胺等;交联剂与引发剂的选择需要兼顾功能性和溶解性,常见交联剂有乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯和戊二醛等,常见引发剂有偶氮二异丁腈、过硫酸铵和过硫酸钾等。偶氮二异丁腈由于反应稳定且副反应较少,是分子印迹技术中最常用的自由基引发剂[35]。此外,分子印迹过程中需要根据印迹种类选择不同溶剂,要求既能够溶解模板分子、功能单体、交联剂、引发剂等一系列物质,又能够为分子印迹聚合物提供多孔结构,常用质子溶剂有甲醇、乙醇和甲酸等,常用非极性溶剂有四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷等。

1.4 分子印迹技术聚合方法

根据模板分子、功能单体不同,分子印迹聚合物有多种制备方法可以选择。一般分为三维分子印迹和二维分子印迹(表面印迹)。根据所选用分子印迹类型及过程状态,三维分子印迹又可以分为本体聚合、分散聚合、沉淀聚合、悬浮聚合和原位聚合;根据聚合反应发生位置,二维分子印迹可以分为自下而上及自上而下的2种制备方法[21,36-37]。随着分子印迹技术不断与生物、化学、物理等学科交叉发展,其聚合方式也不断创新,离子液体、温度敏感型及pH值敏感型分子印迹聚合物的制备已经成为当今分子印迹技术方向的研究热点[38-41]。

2 分子印迹技术在天然活性物质分离研究领域的应用

2.1 分离黄酮类成分

黄酮类化合物是指2个苯环通过3个碳原子相互连接的一系列化合物,如槲皮素、芦丁和桑色素等,其基本碳架为C6—C3—C6结构,广泛存在于蔬菜、水果及各种药用植物中。多项研究表明,黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤和消炎等生理作用,因其卓越的医疗价值一直是中医药及天然产物化学领域研究的热点[42-46]。

朱安宏等[47]以Fe3O4磁性纳米颗粒为载体、槲皮素为模板分子、丙烯酰胺(AM)为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂,按槲皮素与AM物质的量比1∶6制备出分子印迹聚合物,其具有较好的磁学性能同时能够快速高效分离槲皮素。该试验中采用了表面分子印迹的方式。该类表面分子印迹聚合物具有易分离、无需二次处理、可根据需要调节聚合物粒径大小等特点。目前,发展较为成熟的表面分子印迹技术是利用金属离子与组氨酸之间的配位作用力对含有组氨酸片段的多肽与蛋白质进行分离,其本质是将大分子物质的某一部分作为分子印迹结合位点,从而实现对大分子的整体分离,该思路亦可应用于大分子天然活性物质的分离纯化,大多数黄酮中含有苯环、多羟基苯等结构,利用苯酚、苯二酚、苯三酚等小分子作为模板分子,进而印记含有其结构的大分子黄酮,是分子印迹技术应用于黄酮类化合物分离的可行性探索。

有研究[48-49]以芦丁为模板分子、通过等摩尔变换法确定4-乙烯基吡啶(4-VP)与4-乙烯基苯硼酸为双功能单体、以二乙烯基苯与二硫苏糖醇为双交联剂、以2,2-二甲氧基-2-脱氧苯偶姻与2-羟基-4(2-羟乙基)-2-甲基苯丙酮为双引发剂,经光照反应12 h制备得到正电荷胶束型分子印迹聚合物,将其与带负电的柠檬酸三钠修饰的Fe3O4(Fe3O4@CA)载体通过静电相互作用结合,制备得到磁性胶束多功能单体分子印迹聚合物。该磁性胶束多功能单体分子印迹聚合物可以从芦丁结构类似物槲皮素、柚皮苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中特异性吸附芦丁分子,识别特异性因子高达3.55,可以有效地从复杂体系中分离芦丁。黄酮类化合物分子中的C6—C3—C6结构使得黄酮类化合物在结构上往往存在一定相似性,当待分离体系中同时含有多种黄酮类化合物时,由两种及以上的功能单体对模板分子进行印迹的多功能单体法可以更好地对模板分子进行特异性印记及吸附,从而提高针对结构类似物的选择性。由于天然产物常具有相似结构,多功能单体法在分离天然活性物质方向有着较为广泛的应用。邢占芬等[50]在水-甲醇-Cu2+条件下,以AM为功能单体,以配位作用为驱动力制备桑色素-Cu2+配位分子印迹聚合物,该聚合物具有特异性识别率高、结合力强、识别速度快等特点,解决了以氢键为驱动力的分子印迹聚合物在极性环境中识别能力严重下降的问题,对桑色素最大吸附量可达82 μmol/g,远大于非配位吸附方式,是一种高效分离桑色素的聚合物。

黄酮类化合物作为一种具有较高医疗价值的天然活性物质,其单一组分的提取一直是研究者们所追求的目标。2017～2022年分子印迹技术分离黄酮类成分的应用见表1。目前,黄酮类化合物主要通过有机溶剂萃取、碱提酸沉、微波辅助萃取等方法提取得到总黄酮,如何对总黄酮中不同组分进行分离一直是科研工作者研究的重点。现行方法下,即使对同一种黄酮进行分离,常需要针对不同植物类型、溶剂体系、黄酮种类等因素进行调整,重复率低,耗时耗力。分子印迹技术作为一种针对目标化合物特异性分离的技术,对其原料类型及分离体系要求不高,从而可以解决上述大部分问题。分子印迹化合物是一种便捷高效且可重复利用的新型材料,受到了许多科研工作者的青睐。

表1 2017～2022年分子印迹技术分离黄酮类物质的应用1)

2.2 分离多酚类成分

多酚类化合物是植物中一种含有多个酚羟基化合物的统称,其在植物中含量丰富且种类繁多,具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等功效,是多种药物的前体物质,常见多酚类成分有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、白藜芦醇和没食子酸等[58-62]。

Yu等[63]以壳聚糖为功能单体,制备EGCG印迹壳聚糖微球用于选择与分离EGCG,结果表明:EGCG与壳聚糖上氨基之间的氢键是吸附与识别过程中主要驱动力,于313 K下该微球对EGCG最大吸附量为135.50 mg/g,印迹因子为4.22,重复使用5次后其吸附容量为初始吸附量的93.33%,具有良好的吸附性能与可重复性。利用分子印迹方法在茶多酚原液中对EGCG进行提取,与传统方法相比,可以显著提高EGCG的提取效率与纯度,可以高效便捷地将其与茶多酚原液中其他物质分离。何慧清等[64-65]以白藜芦醇为模板分子、α-甲基丙烯酸(MAA)为功能单体、EGDMA为交联剂,按照物质的量比1∶4∶25采用甲醇沉淀聚合法制得分子印迹聚合物,并以此为固相萃取柱填料制备了白藜芦醇分子印迹聚合物固相萃取柱,该萃取柱对花生中白藜芦醇具有显著的分离效果,白藜芦醇经分离、纯化后纯度可达92.5%。固相萃取是一种将分离与浓缩两步合并的一种高效、便捷的分离手段,其本质是依靠样品在固定相与流动相之间分配系数的不同实现对不同物质的分离纯化。传统固相萃取柱具有吸附率与回收率较低、固相萃取柱多为一次性使用、操作繁琐等缺点,而分子印迹的特异性识别为固相萃取柱提供了一种新的发展思路。该试验制备得到的分子印迹柱,可以有效地从花生根、茎部位提取白藜芦醇。

王斌[65]以Fe3O4为载体、没食子酸为模板分子、 4-VP为功能单体、EGDMA为交联剂,制备了磁性硅基Fe3O4@SiO2@MIPs,对没食子酸吸附量为15.77 mg/g,重复使用6次后仍具有89.25%的初始吸附量,实现了没食子酸的快速富集分离。该方法制备的Fe3O4@SiO2分子印迹聚合物具有良好的亲水性,相较于传统非亲水性分子印迹聚合物可以更加高效地从水溶液中分离没食子酸。

多酚作为一种重要抗氧化剂,多存在于植物中,通过分子印迹技术可以高效、便捷地将多酚从植物成分提取液中与其他组分分离,从而实现多酚类化合物的高效提取与纯化,2017～2022年分子印迹技术用于多酚类物质分离实例统计见表2。

表2 2017～2022年分子印迹技术分离多酚类物质实例1)

当前,分子印迹技术分离多酚类成分主要存在问题是某些多酚类化合物结构较为相似,例如表没食子儿茶素与表儿茶素结构上只相差一个羟基。如何准确地将结构类似的多酚准确印记,从而提升分子印迹技术对多酚化合物的专一性是限制其工业化的主要瓶颈。目前,解决此问题的主要方法有多模板分子印迹及对提取液进行前处理等。

2.3 分离生物碱类成分

生物碱是一类广泛存在于动植物体内的含氮碱性有机化合物,其具有消炎、抗病毒和抗肿瘤等功效,是近年来医药领域研究的热点之一,目前可以通过分离得到的生物碱约7 000余种[75-76]。生物碱作为模板分子易通过静电相互作用或氢键作用与酸性功能单体链接,近年来分子印迹技术越来越多地应用于生物碱的分离与纯化(表3)。

表3 2017～2022年分子印迹技术分离生物碱类物质实例

Jiao等[85]制备出可用于废水中选择性提取茶碱的分子印迹聚合物,以MAA为功能单体、EGDMA为交联剂,制得的聚合物在220 ℃下有良好的稳定性,在pH值7.0时与茶碱有最强静电相互作用,最大吸附量为14.55 mg/g,其具有较强的选择性与可重复使用性。Lv等[86]将3-氨丙基三乙氧基硅烷与丙烯酰胺合成的杂化单体用于分子印迹聚合物的合成,并将其用于萃取分离绿茶中的茶碱,分子印迹聚合物回收率为93.7%,对茶碱具有较高的选择性与识别能力。袁新华等[87]以苦参碱为模板分子、苯酚为功能单体,制得酚羟基修饰树脂型分子印迹聚合物,该分子印迹聚合物可以高效识别苦参碱,对苦参碱选择系数为15.67。

2.4 分离有机酸类成分

有机酸是从植物中分离得到的一类含有羧基的酸性化合物,除游离态外自然界中有机酸常以酯或盐的形式存在,具有抑菌、抗炎等功效。常见有机酸有阿魏酸、绿原酸等[88-89]。王娇[90]以阿魏酸为模板分子、MAA为功能单体、EGDMA为交联剂,3者物质的量比为1∶40∶40,预聚合20 min后紫外光照射1.5 h,以紫外光引发聚合方式制备阿魏酸分子印迹复合膜,所制的分子印迹复合膜对阿魏酸具有较好渗透选择性与特异性识别性能,最大吸附量为12.12 mg/g。韦美华等[91]以聚偏氟乙烯作为支撑膜,制备出含有无机纳米粒子阿魏酸分子印迹复合膜,无机纳米粒子的加入有利于复合膜空穴结构的维持,该改良方法使分子印迹复合膜承压能力增强且仍然具有较高的分离效率,承压能力大于0.4 MPa,分离因子约3.1。彭胜等[92]以绿原酸为模板分子,间苯二酚和三聚氰胺为双功能单体,甲醛为交联剂,磁性介孔二氧化硅为载体,合成亲水性分子印迹树脂,可以快速吸附绿原酸并应用于HPLC检测,其具有较强的吸附容量(50.87 mg/g)、较快的吸附速率(吸附平衡时间70 min)和较好的特异性吸附性能。程开茂等[93]探索了新型冰凝胶聚合物的制备方法,以MAA为功能单体,甲叉双丙烯酰胺为交联剂,于-18 ℃下反应24 h制备了分子印迹聚合物,其对绿原酸最大吸附量为73.8 mg/g。

有机酸作为一类酸性天然活性物质,其游离态组分的分离一直是天然产物化学中研究的重点。常用的有机酸提取技术包括浸提法、索氏提取法、水蒸气蒸馏法等传统提取方法,以及超声波提取法、超临界流体萃取法、酶工程法等新型方法。传统方法能耗高、耗时长,新型方法成本高、操作复杂,而分子印迹技术因具有对溶液体系要求不高、特异性强、简便、快速等优点已经越来越多地应用于有机酸类天然活性物质的分离与纯化。

2.5 分离甾体类成分

甾体是一类广泛存在于动植物体内、以环戊烷全氢菲为骨架的天然活性物质,如胆固醇、胆汁酸和肾上腺皮质激素等,常被应用于生物、医药领域[94]。

甾体化合物之间理化性质十分接近,通过萃取、色谱和沉降等方式很难得到单一甾体纯净物,借助于分子印迹技术特异性识别的特点可以针对性地提取某一种甾体,为其进一步应用奠定了基础。

2.6 分离其他种类天然活性物质

除上述天然活性物质外,分子印迹技术在分离萜类、多糖、香豆素、核酸、多肽、苷类等物质方面亦有广泛应用。苏立强等[98]以介孔材料(MCM-41型)为载体,利用表面印迹技术制备青蒿素MIPs,其对青蒿素具有良好的选择性,最大吸附量为102.25 mg/g,35 min内可快速达到吸附平衡。王可兴等[99]以MAA为功能单体、EDGMA为交联剂,制备紫杉醇MIPs,当MAA与紫杉醇物质的量比4∶1,聚合温度为60 ℃ 时,制得的聚合物对紫杉醇最大吸附量为3.66 mg/g。黄微薇等[100]针对多糖大分子结构复杂多样的特点,以3-氨基苯硼酸、 2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为双功能单体,以Fe3O4@SiO2@GLYMO为基体,对淀粉进行分子印迹,制备得到环氧功能化双功能磁性分子印迹聚合物,其对淀粉有较强的吸附性与特异性识别能力,饱和吸附量达到13.88 mg/g,印迹因子达到3.04,且具有可重复使用特点。宋立新等[101-102]通过悬浮聚合法及原子转移自由基聚合法合成7-乙酰氧基-4-甲基香豆素MIPs,在模板分子与功能单体物质的量比为1∶80,引发剂量为单体质量1.5%,温度60 ℃条件下可制得具有香豆素高选择性的分子印迹聚合物。

总的来说,天然产物成分相对复杂,传统分离方式仍存在较多弊端,而分子印迹技术因其高效、便捷、特异性强和灵敏度高等诸多优点受到越来越多的科研工作者的青睐,已经成为天然产物化学中纯化、鉴别和分析的一项重要手段[103]。

3 结论与展望

天然活性物质是一种复杂的混合物体系,如何有效分离各类天然活性物质是制约天然产物化学发展的重要因素。目前,常用的分离手段过程繁琐且不易操作。分子印迹技术作为一种近年来飞速发展的选择性分离及分子识别技术,可以作为天然活性物质分离与纯化的新方式。但作为一种新型分离手段,其目前仍然存在一些问题,具体如下:1) 目前所制备分子印迹聚合物主要采用非极性材料,以识别疏水性分子居多,且其制备大多需要在有机相中进行,限制了其在水相体系中的应用,给水溶性天然活性物质的分离带来了障碍,如何将分子印迹技术拓展至亲水性天然活性物质,以及水相体系下分子印迹聚合物的制备尚待研究;2) 目前分子印迹聚合物与目标分子结合速率无法满足天然活性物质分离工业化需求,制约了其在工业化方面应用,且绝大多数分子印迹过程仅限于实验室研究,探究快速高效的工业化天然活性物质分子印迹技术是未来的研究需求之一;3) 目前大多数功能单体只针对小分子物质,难以构建针对生物大分子(如核酸、蛋白质和酶等)的特异性分子印迹聚合物,构建空间可容纳天然大分子且具有稳定结构的分子印迹聚合物是将分子印迹技术应用于分离天然活性生物大分子物质的先决条件。总的来说,分子印迹技术作为一种能够特异性识别与分离特定分子的技术,其在天然产物化学领域将有广阔的应用前景,可成为推动分离天然活性物质发展的强劲动力。