毕节地区产ESBLs大肠埃希菌的耐药性及基因分型研究

罗 嫚，吴太琴，胡 夷

（毕节市中医医院检验科，贵州 毕节 551700）

大肠埃希菌是人体肠道当中的一种正常且重要的菌群，如果机体出现抵抗力、免疫力下降的情况，或者是遭受细菌侵袭，且已进入到肠道外组织器官，此时大肠埃希菌便有引起多种疾病的可能，比如肺炎、尿路感染及败血症等[1]。近年来，伴随抗菌药物种类的日渐增多，使用频率、量的逐渐增加，使得大肠埃希菌的耐药性也呈现出不断增加的趋势[2]；需指出的是，产生超广谱β- 内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌耐药的典型机制。产ESBLs 的大肠埃希菌有多种基因型，且在各地区、不同国家之间，有着不同的流行情况[3]。为深入剖析毕节地区产ESBLs 大肠埃希菌的实际耐药性情况以及基因分型情况，本文特选取本院所采集的产ESBLs 大肠埃希菌菌株开展药敏试验，并检测其基因分型，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

在2019 年12 月至2020 年12 月这一阶段内，以门诊、住院病人为对象，共选取2217 例，对其各类标本进行采集（如血液标本、脓液标本、痰液标本及尿液标本等），进行培养，得到大肠埃希菌菌株85 株。其中，45 株是产ESBLs 大肠埃希菌。对于所分离的菌株，使用甘油肉汤菌株保存液在冰箱中予以保存（-20℃）。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 选用由法国生物梅里埃公司生产的VITEK 2 Compact 微生物鉴定及药敏分析仪，杭州安誉科技有限公司生产的荧光定量PCR 仪（AGS4800型），法国生物梅里埃公司生产的革兰阴性细菌鉴定卡及药敏卡；选用由南京诺唯赞生物科技有限公司生产的质粒提取试剂盒及由Oxoid 公司提供的ESBLs 确证药敏纸片；采用由郑州博赛生物技术股份有限公司生产的M-H 琼脂平板、麦康凯平板与血平板。

1.2.2 操作方法 （1）鉴定菌株及开展药敏试验。对病人感染处的标本进行采集，依据《临床微生物检验标准化操作》[4]中的相关要求，开展细菌培养，并进行分纯处理。用VITEK 2 Compact 微生物鉴定及药敏分析仪、配套的药敏卡、革兰阴性细菌鉴定卡进行实时鉴定，并开展药敏试验。（2）ESBLs 确证试验。经药敏卡证实为产ESBLs 菌株后，参照双纸片协同法〔美国临床和实验室标准协会（CLSI）所推荐〕开展规范化的表型确证试验操作，即：分别用两组纸片实施试验（一组为头孢他啶及头孢他啶/ 克拉维酸，另外一组是头孢噻肟及头孢噻肟/ 克拉维酸）；如果与不加克拉维酸相比，加克拉维酸后抑菌环直径增加≥5 mm，便可明确为产ESBLs 菌株。质控菌株：药敏试验的质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC27853）、大肠埃希菌（ATCC25922）；将大肠埃希菌（ATCC25922）当作ESBLs 确证试验的阴性质控菌株，而把肺炎克雷伯菌（ATCC70063）当作其阳性质控菌株。（3）检测ESBLs 基因型。用质粒提取试剂盒对45 株菌株进行质粒提取。基本的操作流程：将菌株保存液从冰箱中拿出，使其恢复至室温状态，然后转种血平板，于特定温度下（37℃）持续培养24 h；选1 个菌落，置入5 mL 肉汤管进行增菌处理，然后用质粒提取试剂盒进行菌液的质粒提取。严格按照试剂盒说明书进行操作，提取的质粒保存于-20℃的环境中。对各基因型实施PCR 扩增。分别取核酸荧光PCR 检测混合液（n×36 μL）、扩增酶（n×0.4 μL）（其中，n 代表的是样本数），制作研究所需要的反应液。将适量反应液（36 μL）、质粒（4 μL）加入各管当中，实施PCR 扩增。PCR 扩增的基本条件：预温2 分钟（37℃），预变性2 分钟（94℃），1 个循环；变性15 s（93℃），退火（60℃）及延伸1 分钟，40 个循环。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选阳性产物送至安徽通用生物股份有限公司进行测序。扩增引物序列见表1。

表1 待测基因对应的引物序列

2 结果

2.1 大肠埃希菌对于各种抗菌药所具有的耐药性

收集到85 株大肠埃希菌菌株，其中45 株为产ESBLs 菌株，占比为52.94%。经药敏试验得知，青霉烯类（厄他培南、亚胺培南）、β- 内酰胺酶抑制剂复方制剂（哌拉西林/ 他唑巴坦）对产ESBLs 菌株的抗菌作用最强，氨基糖苷类（阿米卡星）、硝基呋喃类的抗菌活性较强，磺胺类、喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星）抗菌药的抗菌活性较弱。见表2。

表2 45 株产ESBLs 大肠埃希菌菌株对各抗菌药的耐药情况（%）

2.2 基因分型

对45 株产ESBLs 大肠埃希菌开展ESBLs 基因分型检测操作，PCR 后行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图1），挑选有条带的PCR 扩增产物进行测序分析，测序结果显示，产ESBLs 大肠埃希菌中携带CTX-M型基因的有45 株，携带TEM 型基因的有43 株，携带OXA 型基因的有32 株，携带SHV 型基因的有14 株，见表3。

图1 PCR 扩增电泳图

表3 45 株产ESBLs 大肠埃希菌的基因分布情况[株(%)]

3 讨论

大肠埃希菌是一种在临床中较为常见的条件致病菌，是造成医院感染的典型致病菌。近年来，随着抗菌药种类的日渐增多，相关用药量的不断增大，以及用药时间的持续增加，使得大肠埃希菌的耐药性也呈现出随之增加的趋势[5]。产生ESBLs 是大肠埃希菌耐药的典型机制。ESBLs 作为一类酶，可以对多种类型的抗菌药进行水解，比如单酰胺环类、头孢菌素类、青霉素类等[6-7]。产ESBLs 菌株早在1983 年便已经被成功分离检出，自此之后，其在医院感染当中的检出率呈现出逐年且快速增加的趋势[8]。产ESBLs 菌株的出现增加了抗感染治疗的难度，受此影响，不仅会延长病人的住院时间，而且还会增加其治疗费用及痛苦，升高死亡率[9]。本研究的结果显示，产ESBLs 大肠埃希菌的检出率是52.94%，此结果高于某学者[10]的研究数据，与某报道[11]的结论相一致。究其原因，可能与地区不同、使用抗菌药的剂量、种类等存在一定差异相关。从药敏结果得知，对于头孢曲松、氨苄西林等β- 内酰胺环类药物而言，产ESBLs 菌株对其耐药率均为100%，故临床上在选药时，应注意避免使用此类药；产ESBLs 菌株对氨基糖苷类以及硝基呋喃类药物的耐药率均小于50%，临床上可视情况使用此类药物进行相关治疗。需要注意的是，产ESBLs 菌株对氨苄西林/ 舒巴坦这一β- 内酰胺酶抑制剂复合制剂存在显著耐药情况，但对哌拉西林/ 他唑巴坦却比较敏感。究其原因，可能与他唑巴坦在抑酶方面的效果较舒巴坦好、本院较少使用哌拉西林/ 他唑巴坦相关[12]。有研究指出，产ESBLs 菌株除了对β- 内酰胺环类抗菌药物的耐药率较不产ESBLs 菌株高之外，对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类药物的耐药率也较不产ESBLs 菌株高。究其原因，可能与编码ESBLs的质粒能够同时携带其他多种耐药基因有关[13]。碳青霉烯类抗菌药主要有厄他培南、亚胺培南等。此类药物是对多重耐药革兰阴性杆菌所致感染进行治疗时最佳的药物选择。但有研究发现，耐碳青霉烯类抗生素细菌的检出率目前呈逐年上升的趋势，需要引起重视。

现阶段，ESBLs 的基因分型较多，除了有OXA、GES、TLA、SFO 之 外， 还 有PER、VEB、BES、TEM、SHV 及CTX-M 等[14]。本 文 围 绕 常 见 的4 个基因分型实施检测，即OXA、SHV、CTX-M、TEM。结果得知，检出最多的是CTX-M 基因型，其次是TEM 基因型，此结果与相关研究[15]的结论相同。CTX-M 酶又被称作头孢噻肟酶，其可对头孢曲松、头孢噻肟进行高度的水解，本文所得到的产ESBLs 基因型主要是CTX-M，原因与头孢曲松、头孢噻肟在临床中被广泛应用相关。

综上，毕节地区产ESBLs 大肠埃希菌基因型多为TEM、CTX-M 型，且还存在SHV、OXA 型；产ESBLs 菌株对于多种抗菌药均存在较高的耐药性，临床上在选择抗菌药时，应注意避免选择上述药物，以提高用药的准确性、合理性与有效性。