甘草甜素通过调控circ_0009910表达对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移及侵袭的影响

祁顺来 张永刚 朵德龙

(青海省人民医院 1中医科,青海 西宁 817000;2药学部)

鼻咽癌是我国常见的头颈部肿瘤之一,患者5年生存率较低,大部分患者对放疗产生不良反应或放疗抵抗性,研究证实中药在肿瘤治疗方面发挥重要作用,雷公藤红素等中药活性成分可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移等〔1～4〕。甘草甜素(GL)是从中药甘草中分离提取的三萜类成分,研究表明其对肝癌、食管癌等多种肿瘤具有抑制作用〔5〕。但GL对鼻咽癌的治疗效果及其可能作用机制尚未可知。环状RNA(circRNA)在肿瘤中异常表达,并可能作为肿瘤诊断及治疗的潜在靶点,研究表明circ_0009910在胃癌中表达水平升高〔6〕。因此,本研究主要探讨GL对鼻咽癌6-10B细胞生物学行为的影响及其对circ_0009910的调控作用,旨在为鼻咽癌药物的研发提供新线索。

1 材料与方法

1.1一般资料 收集2017年5月至2018年11月于青海省人民医院接受手术治疗的39例鼻咽癌患者的鼻咽癌组织、癌旁组织,其中男29例,女10例,年龄53～65岁,平均年龄(60.16±4.21)岁。

1.2药物、细胞与试剂 GL购自南京泽朗医药;人鼻咽癌细胞6-10B购自上海信裕生物;杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)、Opti-MEM减血清培养基、胎牛血清购自美国Gibco;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购自碧云天生物;Matrigel购自北京索莱宝;Transwell小室购自美国Corning;Trizol购自北京全式金生物;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen;si-circ_0009910、si-NC购自广州锐博生物;逆转录试剂、SYBR荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂购自北京天根生化;兔抗人Ki-67、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗体购自美国CST;二抗购自北京中杉金桥生物。StepOne Plus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI。

1.3实验分组 6-10B细胞接种于6孔细胞板,每孔1×105个细胞,分别用含10、20、40 μmol/L GL的DMEM培养基孵育24 h〔7〕,记为低剂量GL(GL-L)组、中剂量GL(GL-M)组、高剂量GL(GL-H)组。用不含GL的DMEM培养基孵育的6-10B细胞作为对照(Con)组。采用Opti-MEM减血清培养基与si-NC、si-circ_0009910充分混匀后室温孵育5 min记为A液,Lipofectamine2000与Opti-MEM减血清培养基充分混匀后记为B液,将A液与B液充分混匀后室温孵育20 min,转染6 h后将培养基更换为DMEM正常培养基继续培养24 h,依次记为si-NC组、si-circ_0009910组。按照同样的方法分别转染pcDNA、pcDNA-circ_0009910至6-10B细胞6 h后加入含有浓度为40 μmol/L的GL培养液继续培养24 h,分别记为GL+pcDNA组、GL+pcDNA-circ_0009910组。

1.4MTT检测细胞增殖 将3×103个6-10B细胞接种于96孔板,依据“1.3”分组方法处理后,每孔加入20 μl MTT试剂,4 h后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,应用酶标仪检测光密度(OD)值并按照公式〔(抑制率=对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%〕计算细胞增殖抑制率。

1.5Transwell法测定细胞迁移、侵袭 将各组6-10B细胞(1×105个/ml)加入含(侵袭实验)或不含(迁移)40 μl Matrigel基质胶稀释液小室的上室(200 μl/孔),小室的下室加入培养液(含10%胎牛血清)600 μl,培养24 h后,从培养箱中取出细胞隔室。4%多聚甲醛固定迁移或侵袭的细胞20 min,固定后,细胞用0.1%结晶紫染液染色10 min,干燥后拍照计数。

1.6实时荧光定量-PCR测定circ_0009910表达 采用Trizol从鼻咽癌组织与各组6-10B细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,cDNA加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀释20倍,使用SYBR荧光定量PCR试剂配制qRT-PCR扩增反应体系。StepOnePlus实时荧光定量-PCR仪用来检测circ_0009910相对表达水平。

1.7Western印迹检测Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达 提取6-10B细胞蛋白,检测蛋白浓度后,将含有上样缓冲液的蛋白混合物上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)2 h,转移到聚偏二氟乙烯膜,用WB阻断缓冲液阻断2 h。然后用Ki-67(1∶800)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗孵育在4 ℃孵育24 h,再用1∶2 000稀释的二抗在室温下孵育1 h。最后,用电化学发光(ECL)显影,并用自动凝胶成像系统分析各蛋白条带灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1GL对鼻咽癌6-10B细胞增殖的影响 不同剂量GL处理后可促使细胞增殖抑制率升高而抑制Ki-67蛋白表达,呈剂量依赖性,不同剂量GL组间差异有统计学意义(P<0.001),见图1、表1。

表1 GL对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移及侵袭的影响

图1 Western印迹检测各组Ki-67蛋白表达

2.2GL对鼻咽癌6-10B细胞迁移、侵袭的影响 不同剂量GL处理后可抑制细胞迁移及侵袭,抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达,呈剂量依赖性,且不同剂量GL组间差异有统计学意义(P<0.001),见表1、图2。

图2 Western印迹检测MMP-2、MMP-9蛋白表达

2.3鼻咽癌组织中circ_0009910表达比较 circ_0009910在鼻咽癌组织中表达水平(3.85±0.21)显著高于癌旁组织(1.00±0.00;t=40.714,P<0.001)。

2.4GL对鼻咽癌细胞circ_0009910表达的影响 与Con组circ_0009910表达水平(1.00±0.00)比较,GL-L组(0.76±0.04)、GL-M组(0.58±0.03)、GL-H组(0.39±0.03)circ_0009910表达水平显著降低,且呈剂量依赖性,不同剂量GL组间差异有统计学意义(F=716.029,P<0.001)。

2.5抑制circ_0009910表达影响鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭 与si-NC组比较,si-circ_0009910组增殖抑制率增加,迁移、侵袭细胞数及Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平下降,差异有统计学意义(P<0.001),见表2、图3。

表2 抑制circ_0009910表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达影响

图3 抑制circ_0009910表达影响鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白

2.6circ_0009910过表达逆转GL对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与GL+pcDNA组比较,GL+pcDNA-circ_0009910组细胞增殖抑制率下降,迁移及侵袭细胞数增多,Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.001),见图4、表3。

表3 circ_0009910过表达逆转GL对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1,2:GL+pcDNA组、GL+pcDNA-circ_0009910组

3 讨 论

本研究结果显示,GL使鼻咽癌细胞增殖被抑制,并可抑制Ki-67的表达,且随着药物浓度的增加而明显变化。GL具有抗炎、调节免疫的作用,并可抑制肿瘤细胞生长,研究表明GL可抑制乳腺癌细胞增殖〔8〕。另外,GL可抑制胃癌细胞增殖、黏附及迁移〔9〕。GL可能通过B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl相关X基因(Bax)促进舌癌细胞凋亡并抑制增殖及侵袭〔10〕。研究表明Ki-67在鼻咽癌中呈高表达,其高表达量与细胞增殖密切相关〔11〕。本研究结果提示,GL以剂量依赖的方式阻滞鼻咽癌细胞增殖。鼻咽癌细胞中MMP-2、MMP-9表达上调,其可通过降解细胞外基质沉积来提高细胞转移能力〔12〕。本研究结果显示,GL可抑制鼻咽癌细胞迁移及侵袭,且呈剂量依赖性。但GL调控鼻咽癌细胞生物学行为的分子机制仍有待探索。

本研究提示,GL对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用可能是通过降低circ_0009910表达实现的。研究显示,circ_0009910通过miR-335-5p/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)1轴促进肝癌细胞的增殖和转移〔13〕。沉默circ_0009910可通过增加miR-20a-5p抑制急性髓性白血病细胞的生长〔14〕。circ_0009910通过调控miR-449a/白细胞介素(IL)-6R而促进骨肉瘤的发生及发展〔15〕。本研究结果显示,GL对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响可被circ_0009910过表达所恢复。

综上所述,GL可降低鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,鼻咽癌组织中circ_0009910表达增强,GL可通过降低circ_0009910表达阻碍鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭。