肿瘤相关中性粒细胞的双向调控作用及其在膀胱尿路上皮癌中的研究进展

邓凯 杨萌 张琳 钱俊安 史云强 王春晖，2

1昆明医科大学附属延安医院泌尿外科（昆明 650000）；2云南省肿瘤免疫防治研究重点实验室（昆明 650000）

中性粒细胞在抵御微生物感染及创伤后的炎症损伤过程中发挥重要作用［1-2］。但在肿瘤进展过程中，肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TAN）被认为是一个“旁观者”或“中立派”。而近年来的研究表明TAN 并不是真正的“中立”，相反，TAN 可以通过多种途径抑制或促进肿瘤进展，这种双向调控源于TAN 高度的异质性和可塑性。因其可塑性，TAN 在发育、分化、募集的过程中被诱导极化为许多异质性亚群，表现出不同的功能表型，即TAN 的可塑性和异质性是其发挥双向调控作用的基础。通过操纵TAN 在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的浸润水平或其功能表型，有望为目前的肿瘤治疗带来全新的靶点和思路，但由于其异质性，在讨论TAN 的抑瘤或促瘤作用时，须考虑到具体的肿瘤类型甚至是临床分期的不同。

1 TAN 的异质性和可塑性

TAN来源于骨髓，是人体内数量最多的免疫细胞，具有寿命短和更新快的特点，造血干细胞逐步发育分化为粒细胞-单核细胞祖细胞（granulocytemonocyte progenitors，GMPs）后，在G-CSF及GM-CSF的诱导下，逐步分化成熟。

TAN 发育成熟后大部分仍继续留在骨髓，其释放受到严格的调控。趋化因子受体CXCR4 和CXCR2 及其配体决定了TAN 进入血液循环的数量。其中，CXCR4与CXCL12促使TAN 继续保留在骨髓，CXCR2、CXCL1、CXCL2 促使TAN 进入血液循环当中。G-CSF 通过诱导增加CXCL1、CXCL2或减少CXCL12、 CXCR4 的表达，促进TAN 进入循环，快速升高血液中粒细胞水平。肿瘤细胞也可分泌G-CSF，因此肿瘤患者循环中未成熟TAN 的比例较正常人明显升高。TAN 与各组织的亲和程度也不同，以上各种因素共同作用导致了TAN 在发育阶段以及分布空间上的异质性。

目前关于TAN 亚群的分型尚无特异性的标记分子，常以TAN 亚群表现出的功能表型作为分型依据，将发挥抗肿瘤作用或炎性反应的TAN 称为N1 型，将发挥促肿瘤作用的TAN 称为N2 型。也可以根据分布位置，分为外周血TAN 和肿瘤浸润性中性粒细胞（tumor infiltrating neutrophils，TIN）。根据发育程度的不同，可分为未成熟和成熟TAN［1-3］。

转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）可以诱导TAN 向着N2 极化。经TGF-β 诱导后的TAN 主要为N2 型，而阻断TGF-β 后，TME内CD8+T 细胞的数量和活性均增加，免疫治疗的疗效得到增强，TME 内的TAN 极化方向由N2 转向了N1。IFN-β 可以诱导TAN 想着N1 的方向分化，比如在缺乏IFN-β 时，小鼠肺部肿瘤中以N2 为主，细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和TNF-α 表达低，而经过IFN-β 治疗后TNF-α 及ICAM1 表达增加，T 细胞的活化增强，TAN 向着N1 极化，表现出抗肿瘤特性。

在同一类型肿瘤的不同分期中，TAN 的功能表型也可能存在不同，一般来说，在原发肿瘤早期，TAN 常常以N1 型为主，而随着肿瘤的进展，TME中的TAN 逐渐转变为以N2 为主，一定程度上代表了肿瘤进展的结果［4］。受限于传统定义TAN 亚群的方法，光镜下的细胞或细胞核形态差异并不能将异质性TAN 亚群很好的区分开，对TAN 异质性产生的原因更是知之甚少。虽然近年来有研究提出以组织学染色、电镜分析以及分子表型等对TAN 进行更加准确合理的分型，但目前为止尚没有任何一种方法能够用来准确鉴别TAN 的异质性并解释其产生原因。

2 TAN 的双向调控

TAN 是TME 中存在的多种免疫细胞之一［5］，在肿瘤进展过程中发挥重要作用，但其具体是促癌还是抑癌，在不同的研究中得出的结果并不相同：一些研究结果显示TAN 具有抗肿瘤潜力［6-7］，但另一些研究却显示TAN 具有促进肿瘤进展的特性。先前的研究发现，未成熟TAN 的异位出现可能是造成不同功能表型的原因，因为免疫抑制性TAN 通常具有更不成熟的表型，有人甚至将免疫抑制表型的TAN 等同于未成熟TAN，TAN 的成熟与否成为标记TAN 功能表型的重要依据。然而，并不是所有免疫异质性TAN 都是未成熟的，而未成熟的TAN 也不一定就是免疫抑制性的，如血液中免疫抑制性TAN 同样包括已经发育成熟的细胞；CD1-CD66+的未成熟TAN 被证实可以活化T 细胞发挥抗肿瘤活性，而CD10+的成熟TAN 则具备相反的作用。也有人认为是粒细胞内独特的颗粒组成引起了未成熟和成熟TAN 表型的差异。

2.1 抗肿瘤作用在胃癌、结直肠癌（Ⅲ期）和高级别卵巢癌的研究中，TAN 的浸润程度与较好的预后相关，提示TAN 可能具有抗肿瘤潜能，这种抗肿瘤作用通过直接或间接的多种途径实现［2］。

TAN 可以通过自身接触和细胞毒性作用直接杀伤肿瘤细胞［7］，这种杀伤作用与局部缺氧相关而与T 细胞无关，缓解缺氧后，TME 内TAN 的募集减少，但有趣的是，在这种条件下募集的TAN 却能够更有效的杀伤肿瘤细胞［8］。G-CSF、趋化因子、脂多糖以及IFN-β 等多种刺激因素通过与TAN 细胞膜上的相应受体结合，以及转化生长因子-β 受体（TGFβR）信号传导的阻断，可以促进H2O2的产生和释放，导致瞬时受体电位阳离子通道M 亚家族成员2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）的激活和开放，促使Ca2+大量流入，引起肿瘤细胞死亡［9］。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）可通过作用于中性粒细胞上的HGF 受体（也称为MET）促进诱导型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表达和NO 的释放，对肿瘤细胞造成杀伤。TAN 还能通过抗体依赖的细胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）杀伤肿瘤细胞［10］，并以机械性破坏的方式对肿瘤细胞膜进行摄取，造成肿瘤细胞的崩解死亡，该过程涉及信号调节蛋白-α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）与CD47 的相互作用，表明靶向该通路具有潜在的治疗应用价值［2，6］。在一项宫颈腺癌小鼠模型的研究中发现，TAN 还能分泌一种能降解基底膜成分的广谱蛋白酶，促使肿瘤细胞从基底膜脱落，发挥抑制肿瘤的作用（图1A-C）。

除了直接杀伤肿瘤细胞外，TAN 分泌的趋化因子CXCL10、CCL2、CCL3、CXCL1 和 CXCL2，能够募集T 细胞和其他免疫细胞增强抗肿瘤免疫［11］（图1D）。TAN 还可以促进巨噬细胞分泌IL-12，促进非常规T 细胞（CD4-CD8-TCRαβ+double-negative unconventional T cells，UTCαβ）向Ⅰ型免疫反应的极化和IFN-γ 的产生［11］（图1E）。TME 中存在的干扰素-γ（IFN-γ）和GM-CSF 能促进TAN 成熟为抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子，刺激CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化。有趣的是，有体外试验表明TAN 释放的中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）也可以引发和加强T 细胞的抗肿瘤免疫，但目前在癌症患者的文献报道中，NETs 均为促肿瘤作用，故NETs 在体内是否具备抗肿瘤作用尚需进一步的研究［1］。

图1 TAN 的抗肿瘤作用Fig.1 Anti-tumor effects of TAN

2.2 促肿瘤作用在包括非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、肝细胞癌在内的多种肿瘤活检样本中，TAN 的浸润程度与总生存率（overall survival，OS）呈负相关［12］，而术前较高的系统免疫炎症指数和中性粒细胞淋巴细胞比值（neutrophils to lymphocytes ratio，NLR）与多种实体肿瘤的不良预后相关［13-14］。大量体外实验和动物实验也证实了TAN 通过多种途径促进肿瘤进展：

通过释放ROS 造成肺上皮细胞DNA 损伤：这种损伤本身比较轻微，但在致癌物存在的情况下可以被显著放大，从而促进肿瘤的发生，即TAN 通过释放ROS 提高了组织对致癌物质的敏感性［15］。此外，人和小鼠肠黏膜中活化的TAN 可通过释放促炎症的RNA 微粒，促进上皮细胞DNA 的双链断裂，造成基因组不稳定性，组织愈合受损，促进肿瘤发生［16］（图2A）。

通过旁分泌信号通路刺激肿瘤细胞的增殖：在斑马鱼RAS 驱动的肿瘤模型研究中，TAN 通过释放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）或弹性蛋白酶直接促进肿瘤细胞的增殖。此外，白介素1受体拮抗剂（IL-1RA）可以对抗抑癌基因诱导的肿瘤细胞凋亡，间接促进肿瘤增殖（图2B）。

通过抑制其他免疫细胞发挥促瘤作用［1］：TAN 除了通过ROS、iNOS 和精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）等介质实现对T 细胞的直接抑制外［1］，还可以通过 CCL17、CCL2 募集肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）和调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）重塑TME，抑制T 细胞的抗肿瘤免疫。

通过代谢途径塑造抑制性TME：在乳腺癌模型中，肿瘤诱导的中性粒细胞能够通过参与线粒体氧化代谢来维持ROS 的产生以抑制T 细胞［17］。另有研究发现TAN 在分化过程中发生了糖酵解向脂肪酸氧化的转变，通过上调脂肪酸转运蛋白2（fatty acid transporter protein 2，FATP2），增加花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的摄取和PGE2 的合成参与抑制性免疫微环境的形成。

通过表达免疫检查点受体/配体来抑制其他免疫细胞：在人和小鼠肝癌模型及人类胃癌患者中，TAN 通过表达程序性细胞死亡蛋白配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制T 细胞的抗肿瘤反应。而阻断PD-1/PD-L1 后，T 细胞受到的免疫抑制减弱，浸润和活化得到加强［18］（图2D）。

促进肿瘤血管的生成：基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的激活、诱导、血管生成以及早期肿瘤生长有关，主要由肿瘤内TAN 和肿瘤周围的巨噬细胞表达。CD11b+Gr1+TAN 表达的Bv8 蛋白上调可以促进小鼠肿瘤的血管生长，而抗Bv8 抗体可以抑制肿瘤的生长并抑制血管生成，提示TAN 可能在癌变早期通过MMP-9、Bv8 等促进肿瘤组织血管生成（图2C）。

NETs 是一种TAN 胞膜破裂后释放的网状结构，主要由松散的DNA 骨架构成，其他成分还包括MMP9、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、组织蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓系过氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等［19］，NETs通过多种途径促进肿瘤进展［20］（图2B，D，E）。

图2 TAN 的促肿瘤作用Fig.2 Pro-tumor effects of TAN

如前所述，TAN 通过不同的途径在不同种类和临床分期的肿瘤中发挥抗瘤或是促瘤的调控作用，针对这些可能的调控机制，目前已有多种药物正在进行临床试验［6］，如TGFβ 抑制剂用于促进N1 型TAN 的发育，CXCR2 拮抗剂用于抑制TAN向肿瘤的募集，非甾体类药物通过抑制COX2 抑制肿瘤细胞增殖并减轻前列腺素介导的免疫抑制等。即使如此，关于TAN 具体的抗肿瘤或促肿瘤作用机制目前仍不十分清楚，而鉴于TAN 亚群高度的异质性，笔者认为在具体的肿瘤类型中讨论其调控作用可能更为合理。

3 TAN 在UBC 中的研究进展

UBC 被认为是一种高度免疫原性恶性肿瘤，包括非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），TAN 的双向调控作用在UBC 临床诊疗中具有巨大潜力。

3.1 NLR 用于预测UBC 预后多项研究证实外周血NLR与UBC较差的临床预后相关［21-22］，NLR值与肿瘤的分级、分期显著相关，还与NMIBC 患者的高复发风险有关。在一项回顾性分析中，899例UBC患者行根治性膀胱全切术而未行其他辅助治疗，其中，术前较高的NLR 与患者病理分级、膀胱外肿瘤侵犯以及淋巴结转移相关，术前NLR ≥ 2.7 的患者，10年肿瘤特异性生存率更低。因此，NLR 被认为是预测膀胱癌患者预后、分层的重要指标［22-23］。NLR 也被一些研究作为预测高危NMIBC 对BCG 治疗反应性的工具，可为高危NMIBC 患者提供个体化的治疗方案［24］。需要指出的是，绝大多数研究中采用的NLR 指标只能反映外周血中中性粒细胞的数量，并不能反映TME中真实的TAN浸润情况。

3.2 靶向TAN 与其他UBC 经典治疗的联合对于高危NMIBC，经尿道膀胱肿瘤电切术加BCG 膀胱内灌注治疗可以有效降低术后复发率以及肿瘤的进展率。然而一些患者对BCG 治疗并不敏感，而有研究认为NLR 可以作为预测高危NMIBC 对BCG 治疗反应性的工具，并根据评估结果为NMIBC 患者提供最佳的治疗方案［24］

大量研究表明TAN 与MIBC 患者较差的化疗、放疗反应性以及较低的生存率相关，并且TAN 促进肿瘤发生、进展与转移的功能也在一些肿瘤模型中得到验证，靶向TAN 并联合经典放、化疗的疗法显示出一定潜在应用价值。研究表明，UBC 肿瘤细胞可以通过对上调CXCL1、CXCL8，促进TAN分泌VEGFA 和MMP9，促进淋巴管的形成和淋巴结的转移［25］，提示靶向TAN 可能具有抑制UBC 淋巴结转移的潜力。然而有研究表明并不是所有的TAN 浸润水平升高都意味着更差的预后，有文献报道在病理分期为pT2N0M0 时，CCR5+TAN 浸润水平与TNM 分期呈负相关，并且对辅助化疗和ICIs 治疗有更好的反应性［26］。相较于管腔内生型乳头状MIBC，基底型MIBC 显示出明显更高水平的趋化因子吸引中性粒细胞浸润，而二者不同的肿瘤免疫微环境也提示两种类型的MIBC 可能受益于完全不同的治疗方法［27］。

3.3 靶向于TAN 的肿瘤治疗策略及困境基于目前的研究结果，靶向于TAN 的肿瘤治疗策略大致分为两类。首先是通过直接耗竭TAN 或抑制其在TME 中的募集，从而减少N2 亚群的促肿瘤作用，然而，考虑到严重甚至致命感染的明显风险，全身性的中性粒细胞耗竭策略在临床上是不现实的。其次是通过各种办法干预体内TAN 的功能表型，减少N2 亚群的同时增加N1 亚群，其中最常用的方法是阻断TGF-β 或以IFN-β、高剂量的G-CSF诱导，促进TAN 的抗肿瘤潜能，但目前对于TAN亚型的极化机制知之甚少，甚至连诱导后的TAN亚群也无法做到精确的标识和鉴别，尽管如此，TAN 亚群的极化和重塑仍被认为是重要的和潜力巨大的肿瘤治疗策略。也有人提出从外周血提取抗瘤的N1 后再进行外源性输注的技术，然而，这些针对TAN 的全身性操作可能会引起严重的不良事件，如急性肺损伤［6］，并且由于TAN 本身寿命较短，无法长期保持功能状态，需要多次、大量输注粒细胞，存在严重不良反应风险等缺点，该技术的临床应用仍存在争议。

虽然大量研究显示出TAN 双向调控在肿瘤治疗中的临床应用潜力，但鉴于目前的研究结果大部分来源于体外试验或动物实验，这些结论在人体内是否也同样成立尚不得而知，笔者认为，靶向TAN 的肿瘤治疗策略要取得进一步的突破，依赖于对TAN 亚群更深入的研究和更精准的分型，并以此为前提揭示TAN 不同的亚群募集和极化过程中的确切重塑机制。此外，还需要构建更加接近于临床的研究模型，在已有研究成果的基础上进一步讨论TAN 在复杂环境下对肿瘤的调控作用。

4 总结

综上所述，TAN 因其可塑性和复杂的发育分化过程，在不同肿瘤或组织形成具有明显功能表型差异的异质性亚群，这些亚群表现出抗瘤和促瘤的双向调控作用，深刻影响着肿瘤发生、进展和转移过程。目前的研究显示出TAN 应用潜力的同时面临较多未知和挑战，进一步揭示TAN 亚群分型和极化的机制是下一步研究的关键，有望为新一代肿瘤治疗提供新的靶点。

【Author contributions】DENG Kai wrote and revised the article.YANG Meng ，ZHANG Ling，QIAN Jun'an，SHI Yun-qiang revised the article.WANG Chunhui reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.