原发性胆汁性胆管炎胆管上皮细胞凋亡因素及机制的研究进展

杨焕焕 袁诗雨 唐映梅

昆明医科大学第二附属医院胃肠科（昆明 650101）

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种慢性自身免疫性肝病。全球患病率升高，以中国在内的亚太地区患病率升高尤为突出。未经有效治疗，PBC 可最终进展至肝硬化、肝衰竭，将严重影响患者的生存质量［1-2］。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是PBC 治疗的首选药物，但约25%～50%的患者应答不佳。奥贝胆酸是PBC 治疗的二线用药，主要用于对UDCA 应答不佳的患者，但因其可加重患者瘙痒等症状限制了临床应用。肝移植是PBC 相关终末期肝病患者唯一根治性治疗方法，但受供体来源的限制，肝移植成为PBC 治疗的一个重要挑战［3-4］。BEC 占肝脏细胞总数的5%，是PBC时免疫破坏的主要靶目标。BEC 在多种刺激条件下被激活通过增殖以弥补损伤的BEC。但随着疾病的进展，BEC 凋亡逐渐增多，细胞增殖能力减弱，最终导致胆管的进行性缺失［5］。与健康人相比，PBC 患者BEC 中DNA 碎片增多，且PBC 患者BEC 中的Fas、FasL、TRAIL、颗粒酶B、穿孔蛋白表达水平显著升高。同时，PBC时BEC 中凋亡相关基因WAF1 和P53 表达亦明显上调，提示PBC时BEC凋亡增加［6］。诸多因素如自身抗原的暴露、异常免疫反应、胆汁淤积、肠道菌群的改变及氧化应激等因素均会导致BEC 凋亡，而BEC 凋亡又会促进上述因素的形成，继而形成恶性循环，推动PBC 不断的进展。BEC 凋亡在PBC 疾病的发生发展中具有重要作用，深入探究影响BEC 凋亡的因素及相关机制，可为开发新的PBC 治疗靶点提供新思路，从而使更多的PBC 患者受益。

1 PBC 时线粒体自身抗原暴露促进BEC凋亡的发生

PBC 时机体免疫异常打破对自身抗原的免疫耐受，造成肝内中、小胆管的靶向损伤，导致胆管缺失和胆汁淤积［7］。因为BEC 缺乏谷胱甘肽的修饰，BEC 在凋亡过程中PDC-E2 可保持免疫原性并可进入凋亡小体，随后被循环中的抗线粒体抗体（AMA）识别，并形成抗原抗体复合物，进一步激活免疫反应和导致BEC 凋亡［5］。同时，脱落的凋亡小体形成新生抗原刺激炎症细胞释放炎症细胞因子，加重局部炎症状态，由此引起更多的BEC 凋亡［6］。免疫细胞的攻击也会导致BEC 自身抗原的暴露，例如在NK/BEC 的比值升高的情况下，NK 细胞攻击BEC 并释放自身抗原成分激活自身反应性T 淋巴细胞而导致BEC 损伤［8］。凋亡细胞通常会被专业吞噬细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）和邻近非专业吞噬细胞（如上皮细胞等）吞噬，随后吞噬体和溶酶体融合降解凋亡细胞。但PBC 时一方面巨噬细胞存在胞葬功能障碍，这导致凋亡细胞不能被巨噬细胞及时有效清除，致使凋亡细胞不断积累和自身抗原的持续性暴露，继而引发广泛的自身免疫反应，促进BEC 凋亡；另一方面，PBC时邻近的正常BEC 吞噬凋亡BEC 的同时会摄入凋亡BEC 中的自身反应蛋白等成分，从而提供自身抗原的持久性来源，使BEC 不断受到免疫攻击和损伤［9-10］。线粒体自身抗原的暴露是BEC 凋亡的促进因素，而通过促进BEC 谷胱甘肽的修饰，改善巨噬细胞的胞葬功能等来抑制自身抗原的暴露可能是PBC 的一个潜在治疗靶点。

2 PBC 时异常免疫反应在BEC 凋亡中具有重要作用

PBC 的主要病理基础是T 淋巴细胞浸润为主，其他多种天然免疫细胞参与的肝内胆管上皮细胞的免疫破坏［11］。BEC 表达多种Toll 样受体（Tolllike receptors，TLR），微生物及代谢产物等与之结合激活TLR 促进BEC 分泌 CX3CL1、IL-6、TNFα 等趋化因子和细胞因子，后者可招募多种免疫细胞浸润至门静脉和BEC 周围［12］，这些免疫细胞通过不同作用机制促进BEC 凋亡，进而导致胆管进行性减少和胆汁淤积等，最终导致PBC 不可逆性进展。

2.1 CD4+T 淋巴细胞和CD8+T 淋巴细胞T 淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，PBC 患者门静脉有大量CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞浸润。CD4+T 淋巴细胞除了可以通过直接分泌IL-6，12，17，21 和IFN-γ 等细胞因子促进细胞损伤，还可以通过增强和维持CD8+T 淋巴细胞反应和刺激B 淋巴细胞分化为浆细胞产生抗体从而促进BEC 凋亡的发生。与CD4+T 细胞相比，CD8+T 细胞对BEC 具有更直接的杀伤作用，主要通过表达FasL 与BEC表达上调的Fas 受体结合及释放穿孔素和颗粒酶两种方式诱导BEC 凋亡。其次，CD8+T 细胞还可以通过表达KLRG1和分泌IFN-γ促进BEC损伤［8，13］。

2.2 Th1、Th17、Treg 和Tfh 细胞CD4+T 淋巴细胞在不同细胞因子的刺激下可分化为Th1 和Th17细胞，可分别通过产生IFN-γ 和IL-17 诱导BEC 凋亡。PBC 患者外周血中Treg 细胞的数量显著减少，同时单核细胞浸润增加，血清AMA 抗体增加，Treg 细胞的数量减少和功能异常可能导致自身反应性T 细胞不受控制激活，导致促炎细胞因子的产生，进一步加重BEC 凋亡和损伤。此外，PBC 患者循环中的滤泡辅助性T（Tfh）细胞增多，在受到抗原等刺激后IL-21 生成增多，继而促进自身反应性B 淋巴细胞分化为浆细胞并产生AMA 抗体。表明Tfh 细胞通过参与AMA 的产生间接介导PBC患者BEC 凋亡和损伤［13］。

2.3 B 淋巴细胞B 淋巴细胞在PBC 的发病机制中具有重要作用。首先BEC损伤后暴露的PDC-E2激活B 淋巴细胞后通过分泌IL-6、IFN-γ 和TNF-α等细胞因子促进Th1、Th17 细胞增殖与分化可以启动对BEC 的损伤反应［14］；其次，B 细胞通过分化成浆细胞产生抗体形式参与BEC 的凋亡。浆细胞分泌产生的AMA 与凋亡小体中的PDC-E2 形成抗原抗体复合物反过来又可以激活多种免疫细胞，吸引免疫攻击继而导致BEC 损伤；此外，浆细胞还可分泌IgA 抗体并通过pIgR 介导进入胆管上皮细胞并通过激活caspase 途径促进BEC 凋亡［11，13］。

2.4 巨噬细胞巨噬细胞是PBC 发病中重要的先天性免疫细胞，其对BEC 的促凋亡作用主要表现在以下3 个方面：（1）在AMA 存在的情况下，巨噬细胞和凋亡的BEC 共培养时TRAIL 产生显著增加，与BEC 中表达上调的DR5 受体结合促进BEC大量凋亡；（2）抗原抗体抗复合物等刺激使巨噬细胞中的炎症小体NOD 样受体蛋白-3 激活继而促进IL-18、IL-1β 等炎症因子的释放，从而导致周围BEC 凋亡增加［15-16］；（3）PBC 时浸润的巨噬细胞表达CD40L，与BEC 上的CD40 结合后可通过激活NF-KB 和AP-1 途径增加BEC 中FasL 的表达间接促进了BEC 凋亡［17］。

2.5 NK 和NKT 细胞自然杀伤（natural killer ，NK）细胞主要在PBC 患者的门脉区富集，IFN-a 和TLR4 配体是NK 细胞的重要刺激物，可以驱动NK细胞激活通过分泌IFN-γ 和穿孔素有效杀死BEC。除了直接杀伤BEC 外，NK 细胞还能在APC 存在的情况下激活自身反应性CD4+T 细胞进而促进BEC凋亡和疾病进展［8，13］。自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞在接受BEC 呈递的脂质抗原刺激后分泌IFN-γ 并通过FasL 介导BEC 凋亡［18］。

综上所述，在不同刺激因素下先天性和适应性免疫细胞可以单独或通过相互作用的方式共同诱导PBC 时BEC 凋亡的发生。基于免疫介导的发病机制，目前已提出几种关于PBC 免疫治疗策略，如甲氨蝶呤等免疫抑制剂；针对免疫细胞或细胞因子的靶向药物，如B 细胞靶向疗法和抗CD20 单克隆抗体-利妥昔单抗等，但上述免疫治疗效果有限。PBC 是一种自身免疫性肝病，多种免疫细胞和细胞因子均参与了PBC 的发病，因而单独的一种免疫治疗方法可能达不到较好的临床效果，故继续深入研究PBC 时各种免疫细胞在PBC 中的作用及机制，开发联合免疫治疗可能成为未来PBC治疗的一种新的治疗方案。

3 PBC 时胆汁酸代谢异常加重BEC 凋亡

PBC 时BEC 凋亡增加进而导致胆管进行性缺失和胆汁淤积。胆汁淤积时疏水性胆汁酸的增加又可对细胞造成毒性损害，其诱导BEC 凋亡与胞质内游离钙离子的增加、JNK 激活、ROS 生成增强以及Bax 介导的线粒体外膜通透性增加导致细胞色素C 释放相关［19］。阴离子交换蛋白2（anion exchanger protein2，AE2）与胆汁酸的代谢密切相关。AE2 和Ⅲ型肌醇三磷酸受体（InsP3R3）位于BEC的顶膜中，可促进碳酸氢盐的分泌使管腔呈碱性进而防止疏水性胆汁酸进入BEC 并诱导细胞毒性。PBC 时，胆管上皮细胞中的AE2 和InsP3R3 表达降低，一方面使碳酸氢盐在BEC 中积累，激活可溶性腺苷酸环化酶（sAC）—碳酸氢盐的传感器，活化的sAC 通过Bax 的磷酸化、细胞色素C 的释放和Caspase-3 途径参与胆汁酸诱导的BEC 凋亡。另一方面，由于碳酸氢盐的分泌不足，无法与胆汁酸充分结合并形成去质子化的胆汁酸盐，从而使毒性胆汁酸进入BEC 并导致其凋亡。miRNA-506 在BEC 中过表达可抑制AE2 和InsP3R3 的活性，导致PDC-E2 过表达和线粒体功能障碍、促进氧化应激和胆汁酸诱导的细胞凋亡［11，19-21］。熊去氧胆酸是PBC 治疗的是首选药物，其可通过上调BEC 中AE2 的表达，促进碳酸氢盐的分泌，减少疏水性胆汁酸对BEC 的损伤和抑制免疫反应及Bax 的易位维持线粒体膜的稳定性等减少BEC 凋亡，但部分患者对其应答不佳。奥贝胆酸及其他药物虽然也可通过改善胆汁淤积抑制BEC 凋亡及延缓PBC 的进展，但因其副作用限制了其临床应用。miRNA-506、AE2 通过影响胆汁酸代谢在PBC 的发病机制中具有重要作用，靶向miRNA-506、AE2 等的药物研发可能为PBC 的治疗带来新希望。

4 PBC 时肠道菌群的异常改变与BEC 凋亡有关

研究证实肠道菌群的改变与PBC 疾病密切相关，并可加重BEC 凋亡的发生。肝脏通过肠肝轴与肠道紧密相连，失衡的肠道菌群通过此轴可引起一系列的肝脏病理反应。PBC 患者中肠道菌群多样性发生改变，乳酸杆菌等有益菌减少，变形菌、肠杆菌等致病菌增加。微生物和宿主抗原之间的分子模拟可能增强易感个体的自身免疫反应。人与大肠杆菌、支原体等微生物的PDC-E2 成分十分相似，可通过分子模拟机制导致对自身抗原免疫耐受性的打破，诱发自身免疫反应，进而导致BEC 损伤［22-24］。肠道菌群的异位可使巨噬细胞、胆管上皮细胞上的TLR 表达上调，其激活后可释放TNF-α、CCL4 等炎症细胞因子和趋化因子，进而通过炎症反应和吸引免疫攻击继而导致BEC凋亡、肝内胆管缺失和胆汁淤积。胆汁淤积反过来又会导致肠道菌群的改变，形成恶性循环，使更多的BEC 发生凋亡。此外，肠道菌群及代谢产物还会通过促进活性氧的产生、增加氧化应激等方式促进BEC 凋亡［25-27］。多数PBC 患者有肠道菌群的改变，肠道菌群的失衡与PBC 的发病及其预后均相关，其可作为PBC 患者诊断的生化标志物和潜在治疗靶点。

5 PBC 时氧化应激参与BEC 凋亡

氧化应激是指氧化和抗氧化防御之间的不平衡导致的细胞生物学功能损害。PBC 患者血清中氧化应激的生化标志物增多，而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S 转移酶等抗氧化分子水平则显著下降［28-29］。PBC 时IFN-β、TNF-α 等促炎细胞因子可以诱导BEC 活性氧的产生，并通过ATM/p53/p21WAF1/Cip1 通路导致细胞周期阻，BEC 凋亡增加而再生受损，最终导致肝内中小胆管的进行性减少。同时，炎症细胞因子诱导的氧化应激增加了BEC 对化学诱导细胞毒性的敏感性，这与抗氧化酶的抑制密切相关［30-31］。PBC 时氧化应激通常伴有谷胱甘肽的降低，通过增加caspase-3 的活性、降低bcl-2 在BEC 上的表达和诱导P53 及p-JNK 的表达等促进BEC 凋亡，谷胱甘肽抑制剂处理增强了BEC 对氧化剂诱导凋亡的敏感性，说明谷胱甘肽的耗竭在BEC 凋亡中具有重要作用［16］。谷胱甘肽的降低一方面可增强氧化应激对BEC的损伤作用，另一方面降低的谷胱甘肽使PDC-E2的修饰异常而使其保持免疫完整性，继而触发自身免疫反应而导致BEC 损伤。氧化应激还可使线粒体能量代谢障碍及线粒体膜通透性增加、细胞色素C释放增加，继而导致BEC凋亡。抑制氧化应激反应，减少活性氧等的产生，增加外源性谷胱甘肽，可抑制PBC 时BEC 的损伤，进而延缓疾病的进展。

6 PBC 时影响BEC 凋亡的其他因素及相关机制

女性优势是PBC 疾病的另一特征，好发年龄为40～60 岁，随着年龄的增加，体内雌激素水平逐渐下降。雌激素可保护线粒体功能，其缺乏可上调雌激素相关受体γ（estrogen-related receptorγ，ERRγ）的表达并通过增加BEC 中Bcl-2 家族中的促凋亡分子进而增加BEC 凋亡的易感性。在培养人的BEC 中，雌激素相关受体α（estrogen-related receptor α，ERRα）被过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α，PGC-1α）激活，PGC-1α-ERRα 轴诱导脂肪酸氧化产生活性氧促进细胞凋亡［32-33］。Galectin-3（一种半乳糖凝集素）和B7-H4分子在BEC 中表达上调，可分别通过抑制CD8+T淋巴细胞浸润、IgA 抗体的产生和FasL 的产生抑制BEC 凋亡。上述表明Gal-3 和B7-H4 分子是BEC 凋亡的保护性因素。此外，PBC 时BEC 中P53、WAF1 和Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白分子表达上调，则可通过影响细胞周期和线粒体功能促进BEC 凋亡［6，34-35］。影响BEC 凋亡的因素很多，促凋亡和抗凋亡因素的失衡是BEC 凋亡和PBC 疾病进展重要原因，也是PBC 治疗的关键所在。

7 总结与展望

PBC 是一种以中年女性发病为主的自身免疫性肝病，肝内中、小胆管的损伤和胆汁淤积为其主要特点。熊去氧胆酸和奥贝胆酸分别是PBC治疗的一线和二线用药，但有相当一部分患者由于对上述药物应答不佳或因严重副作用而得不到有效治疗，最终进展至终末期肝病。受供体来源的限制，肝移植成为PBC 相关终末期肝病治疗的重要挑战。目前PBC 发病机制尚不完全明确，但越来越多的证据表明BEC凋亡在PBC的发病机制中起重要作用。线粒体自身抗原的暴露、异常免疫反应、毒性胆汁酸、肠道菌群的改变及氧化应激等因素通过不同的作用机制促进PBC时BEC凋亡的发生。进一步深入探索及研究PBC 时影响BEC 凋亡的因素及相关机制可为未来PBC 开发新的治疗靶点或新的治疗方案提出提供坚实的理论基础，这将使更多的PBC 患者受益。

【Author contributions】YANG Huanhuan was responsible for writing the article，YUAN Shiyu was responsible for collecting and organizing the literature，and TANG Yingmei was responsible for revising the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.