多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵与外膜蛋白表达水平分析

黄育波 周宇麒 郑文争 朱家馨 杨海玲 吴文斌 张天托

中山大学附属第三医院呼吸与危重症医学科（广州 510630）

鲍曼不动杆菌是医院内重要的病原菌，由于其在医院环境中的生存能力和迅速获得抗生素耐药性的倾向，已成为临床和耐药菌流行的重要原因［1］。鲍曼不动杆菌在危重患者中可引起各种感染，包括肺炎、血流感染和尿路感染，其中呼吸机相关性肺炎和血液感染最为常见，病死率可达35%［2-3］。2017年，世界卫生组织提出，开发针对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的新型抗生素是当务之急［4］。多重耐药鲍曼不动杆菌的出现和传播对全球的健康已经构成了重大的威胁，对临床抗感染治疗提出了重大挑战［5］。既往研究表明，外排泵和外膜蛋白的表达和鲍曼不动杆菌出现多重耐药（MDR）具有高度密切的关系［6-7］。因此，本研究旨在了解本院鲍曼不动杆菌外排泵（efflux pump）和外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）基因的表达情况，探讨其在本地区鲍曼不动杆菌耐药中的变化和影响，为临床诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集中山大学附属第三医院住院患者下呼吸道标本分离的鲍曼不动杆菌共213 株（2009年1月至2014年3月），上述菌株由呼吸与危重症医学科实验室-80 ℃冰箱低温保存。根据菌株对不同抗生素的敏感性分为不敏感组（NS 组）和敏感组（S 组）。

1.2 菌种鉴定上述临床下呼吸道样本分离培养的213 株鲍曼不动杆菌菌株常规经API 20NE 初步鉴定后，再用分子生物学方法对其进行菌种鉴定，具体方法参照HIGGINS 等［8-9］建立的gyrB 多重PCR 方法进行。以大肠埃希菌ATCC 25922、鲍曼不动杆菌ATCC 17978 作为研究的对照。

1.3 主要试剂和仪器抗生素药敏纸片：阿米卡星（Amikacin，AMK），亚胺培南（Imipenem，IPM），头孢哌酮（Cefoperazon，CFP），头孢吡肟（Cefepime，FEP），哌拉西林/他唑巴坦（Piperacillintazobactam，TZP），头孢他啶（Ceftazidime，CAZ），复方新诺明（SXT），环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），头孢哌酮/舒巴坦（Cefoperazone-sulbactam，SCF），庆大霉素（Gentamicin，CN），多粘菌素B（Polymyxin B，PB），替加环素（Tigecycline，TGC）等，以上抗生素纸片均购自英国OXOID 公司。主要试剂：LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster（Roche 公司，瑞士）；Transcriptor cDNA Synth.Kit 1（Roche 公司，瑞士）；RNAiso Plus（TaKaRa 公司，中国大连）。主要仪器：PCR 扩增仪9700 型（Applied Biosystems公司，美国）；核酸蛋白分析仪DU 730 型（BECKMAN 公司，美国）；RT-PCR 仪LightCycler 480 型（Roche 公司，瑞士）。

1.4 方法

1.4.1 药敏试验药敏试验采用纸片扩散法（K-B法）。根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）公布的2012年版标准对药物的敏感性进行判断，以大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853 作为药敏对照质控菌株［10］。所有操作均严格按照标准规程进行。部分抗生素敏感性参考EUCAST2012 标准。

1.4.2 RNA 提取及cDNA 的合成按照RNA 提取试剂盒（RNAiso Plus，TaKaRa，Code No.9108/9109）提供的方法进行总RNA 提取，结合预实验结果作适当的改进。按照试剂盒（Cat.No.04 897 030 001）提供的方法进行cDNA 的合成（逆转录）。根据下列表1 中相关研究提供的方法，结合预实验结果选择引物序列进行荧光定量PCR。其中引物的合成委托英潍捷基（上海）贸易有限公司进行。以基因rpoB 作为内参基因，检测外排泵基因（adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA）、外膜蛋白基因（omp25、omp33-36、carO）的表达水平，参考引物序列具体见下列表1。

表1 荧光定量PCR 引物序列表［11-14］Tab.1 Primers for fluorescent quantitative PCR

1.4.3 相关基因mRNA相对表达量的计算根据荧光定量PCR 试剂盒（LightCycler®480 SYBR GreenⅠ Master）提供的方法进行操作。内参基因rpoB及各目的基因扩增曲线与溶解曲线均为单峰曲线，表明实验重复性良好且没有非特异性扩增。以鲍曼不动杆菌ATCC 17978 标准株相应基因mRNA 表达量作为参考对照。具体计算公式为mRNA 相对表达量（relative expression，RE）=2-△△Ct，△△Ct=（CtTarget-CtrpoB）目的菌株-（CtTarget-CtrpoB）对照菌株。

1.5 统计学方法本研究使用Excel 表建立研究的数据库，以SPSS 22.0 版软件进行统计学处理和分析。正态分布的计量资料描述采用均数±标准差（），采用独立样本t检验或者单因素方差分析（One-way ANOVA）进行比较；非正态分布的计量资料的描述采用中位数（median，M），采用秩和检验进行比较。定性资料采用χ2检验进行比较。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株的药敏结果经分离培养鉴定的213 株鲍曼不动杆菌对主要抗生素的耐药情况如下（见表2）：上述菌株对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为89.2%、81.2%，对头孢哌酮、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、复方新诺明、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素的不敏感率均超过92%，对多粘菌素B 和替加环素均敏感。

表2 213 株鲍曼不动杆菌耐药情况Tab.2 Susceptibility of 213 strains of A.baumannii to antimicrobial agents株（%）

2.2 外排泵和外膜蛋白基因表达水平研究外排泵基因、外膜蛋白基因表达水平与抗生素耐药之间的关系，检测外排泵基因（adeB、adeJ、adeG、craA、abeM、amvA）、外膜蛋白基因（omp25、omp33-36、carO）的mRNA 的表达水平。根据各菌株对抗生素的敏感性分组，比较不敏感组（NS 组）与敏感组（S 组）在上述基因表达水平的差异。根据各菌株外排泵基因表达量与标准鲍曼不动杆菌ATCC 17978比较，计算上述基因mRNA相对表达量（relative expression，RE），具体算法见1.4.3。由于各组数据为非正态分布资料，以中位数（M）表示其平均水平。结果显示：除adeB 外，其他外排泵如adeJ、adeG、craA、abeM、amvA 各组RE 平均值均小于1。omp25、omp33-36、carO 各组RE 平均值均大于1。见表3。

表3 各抗生素组外排泵基因、外膜蛋白基因RE 值［中位数（M）］Tab.3 Relative expression of efflux pump genes and OMP genes in different antibiotic groups［median（M）］

2.3 各抗生素组RE 分析比较

2.3.1 外排泵adeB基因RE的分析（1）adeB基因RE 的分布情况：由于adeB 基因表达升高（RE ≥ 1）提示可能与抗生素耐药有关，于是根据RE 值是否高于1 对RE 原始数据进行整理，并对抗生素耐药性进行分组统计分析。结果提示：adeB 基因相对表达量（RE ≥ 1）在各抗生素（AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、SXT、CIP、SCF、CN）不敏感组和敏感组的具体分布情况表明，在多数抗生素不敏感组RE ≥ 1 的分布比例高于敏感组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。提示adeB 过度表达与上述抗生素耐药性密切相关。见表4。（2）adeB 基因相对表达量的结果比较分析：外排泵adeB 基因mRNA的RE 值在AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、CIP、SCF、CN 不敏感组和敏感组之间有统计学差异［统计量分别为AMK（χ2=1551.5，P=0.023）；IPM（χ2=2611.5，P=0.016），CFP（χ2=309.0，P=0.036）、FEP（χ2=67.0，P＜ 0.01）、TZP（χ2=73.0，P＜ 0.01）、CAZ（χ2=60.0，P＜ 0.01）、CIP（χ2=67.0，P＜ 0.01）、SCF（χ2=359.0，P＜ 0.01）、CN（χ2=294.0，P＜ 0.01）］，不敏感组adeB 基因的RE值平均水平较高，则该基因过度表达，提示与耐药性关系密切。SXT 不敏感组和敏感组adeB 的RE比较差异无统计学意义（χ2=1 539.0，P=0.602）。见图1。（3）外排泵adeJ、adeG、craA、abeM、amvA 基因RE 值比较分析：为明确其余外排泵如adeJ、adeG、craA、abeM、amvA 是否与本研究所涉及的抗生素有关，检测其基因的mRNA 水平。结果上述基因的RE 值在各个抗生素组（不敏感组与敏感组）大多数（67.1%～99.1%）在0～1.0 之间，且经比较分析无统计学差异。提示这些基因在本研究的鲍曼不动杆菌耐药中不起作用。见表4。

表4 adeB 基因相对表达量（RE≥1）在不同抗生素组分布情况Tab.4 Distribution of adeB gene（RE≥1）in different antibiotic groups株（%）

图1 不同抗生素组adeB 基因相对表达水平比较Fig.1 Comparison of relative expression of adeB gene in different antibiotic groups

2.3.2 外膜蛋白omp25、omp33-36、carO 基因RE比较分析外膜蛋白omp25、omp33-36、carO 基因的表达量，经标准化处理后以相对表达量RE 表示（见表3）。结果显示：外膜蛋白omp25、omp33-36、carO 基因RE 值在各抗生素（AMK、IPM、CFP、FEP、TZP、CAZ、CIP、SCF、CN）的不敏感组和敏感组，其RE 值均超过1.0，提示相对表达量升高。omp25 在AMK（χ2=1 574.5，P=0.029）表达差异有统计学意义。omp33-36 在IPM（χ2=2 635.5，P=0.019）组差异有统计学意义。carO 在AMK（χ2=1 554.5，P=0.024）、FEP（χ2=306.5，P=0.035）、CAZ（χ2=158.0，P=0.002）、CIP（χ2=306.5，P=0.035）组表达差异有统计学意义，其余各组比较差异有统计学意义。主要结果具体见图2-4。

图2 不同抗生素组omp25 基因相对表达水平比较Fig.2 Comparison of relative expression of omp25 gene in different antibiotic groups

图3 不同抗生素组omp33-36 基因相对表达水平比较Fig.3 Comparison of relative expression of omp33-36 gene in different antibiotic groups

图4 不同抗生素组carO 基因相对表达水平比较Fig.4 Comparison of relative expression of carO gene in different antibiotic groups

3 讨论

鲍曼不动杆菌是一种革兰阴性、非发酵的机会致病菌，曾经被认为是良性的鲍曼不动杆菌现在被认为是医疗保健领域的全球威胁，主要是因为它倾向于比以前未曾预见的速度获得多重耐药以及广泛的耐药表型［15］。全球感染的鲍曼不动杆菌约有近45%为多重耐药菌株［16］。尽管碳青霉烯类抗生素被认为是治疗的最后手段，但全球鲍曼不动杆菌对这些抗生素的耐药率仍急剧上升［17］。

据中国耐药监测网报道，2014年不动杆菌属（主要是鲍曼不动杆菌占比93.0%）对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.4% 和66.7%［18］。2021年不动杆菌属对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为65.6% 和66.5%，而对头孢哌酮-舒巴坦的耐药率为48.8%［19］。本研究报告的213 株菌株对阿米卡星、亚胺培南不敏感率分别为89.2%、81.2%，对头孢哌酮、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、复方新诺明、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素的不敏感率均超过92.0%。本院鲍曼不动杆菌耐药率高，可能是重症监护病房来源的多重耐药菌株的比例较高有关，还有可能是多种耐药机制参与了高耐药的发生。目前耐药形势严峻，多耐药菌株的存在，给临床治疗带来了巨大的压力和挑战。

研究表明，鲍曼不动杆菌多重耐药的机制主要是由以下因素共同形成，包括β-内酰胺酶产生、外膜通透性降低、孔蛋白的下调和外排泵表达增加等。细菌外排泵是镶嵌于细胞膜的一组蛋白质，具有识别有毒物质或有毒代谢产物并将其排出胞外的功能，同时增加了鲍曼不动杆菌的致病性［20-21］。RUMBO 等［13］、COYNE 等［12］、DAMIERPIOLLE等［22］多个研究团队的结果表明，鲍曼不动杆菌外排泵系统通过将β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗生素泵出细胞外从而导致耐药的发生。亦有研究表明AdeABC 外排泵系统在碳青霉烯类抗生素耐药中没有起作用［23］。

然而，由于不同研究菌株的背景、来源、耐药谱不尽相同，研究发现各外排泵系统作用的抗生素底物也各不相同，因此相关研究结论也存在差异。一系列相关的研究发现，外排泵adeB 基因在70%～100%的临床鲍曼不动杆菌中有表达。例如WIECZOREK 等［24］研究发现adeB 基因在全部收集的鲍曼不动杆菌（100 株）中表达，该菌株大部分对亚胺培南、美罗培南、等抗生素耐药率高。COYNE等［25］发现外排泵系统存在于80%（约53%～97%）的临床菌株中。LIN 等［26］研究甚至发现仅在75%的临床多重耐药菌株中有表达。上述研究提示，adeB 表达与包括碳青霉烯在内的多种抗生素耐药有关。更有研究表明，AdeABC 外排泵的过表达与碳青霉烯类水解酶（OXA）表达结合时导致高水平的碳青霉烯类抗生素耐药［27-28］。本研究发现在213 株鲍曼不动杆菌中，adeB 基因表达明显升高（RE ≥ 1）所占比例为93.4%。通过比较发现，在多种抗生素不敏感组比敏感组的adeB 基因表达升高的比例更高，提示adeB 表达升高可能是导致其产生多重耐药的重要因素之一。本研究结果与上述研究结果一致，说明adeB 过度表达在本院鲍曼不动杆菌的耐药性方面起到了非常重要的作用。

RUMBO 等［13］研究亦发现adeG、craA、abeM 和amvA 在所研究的菌株中没有升高（RE 值介于0.003～1 之间）。在本研究的临床菌株中，adeJ、adeG、craA、abeM、amvA 基因的相对表达量（RE值）多数（67.1%～99.1%）在0～1.0 之间。本研究结果与其部分较一致，提示上述外排泵系统与鲍曼不动杆菌耐药的产生没有明显相关性。然而，国内HOU 等［29］研究发现，adeJ 和 abeM 在耐碳青霉烯组过度表达，adeB 表达水平亦耐药组较高，该研究推测AdeABC、AdeIJK 和AbeM 三种外排泵系统共同参与了临床菌株耐药的发生。本研究与之相似之处是adeB 的表达增高与碳青霉烯耐药有关，而adeJ、abeM 在本研究抗生素耐药中不起作用，这与上述研究有明显不同。提示可能是研究的临床菌株的来源不同和（或）地区差异所致，亦有其他耐药机制参与的可能。

外膜蛋白表达减少或突变在多重耐药鲍曼不动杆菌中起着重要作用［30］。BOU 等［31］研究发现鲍曼不动杆菌两个外膜蛋白（22 kDa 和33 kDa）表达下降参与了对碳青霉烯抗生素的耐药产生，而不仅仅由于产生OXA 酶导致耐药。DEL 等［32］通过N-末端肽测序研究耐碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌外膜蛋白omp33-36，提示该蛋白表达缺失与碳青霉烯耐药有关。RUMBO 等［13］根据OXA-58 和OXA-24 表达阳性分为两组，carO 和omp25 在OXA-58 组观察到有明显降低，但据研究者推测这种降低与亚胺培南耐药无关，而与β-内酰胺类抗生素耐药有关。MUSSI 等［33］研究证实carO 基因失活导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯抗生素耐药，该研究亦分析CarO 参与了碳青霉烯类抗生素的流入，而自然分解破坏carO 基因导致抗生素流入减少可以解释鲍曼不动杆菌CarO 蛋白的缺失导致了碳青霉烯耐药的发生。FERNÁNDEZ-CUENCA 等［34］通过荧光定量PCR 检测全耐药鲍曼不动杆菌CarO的表达，与鲍曼不动杆菌ATCC 19606 比较发现CarO 表达显著下降，从一定程度提示该蛋白表达缺失与多重耐药关系密切。然而本研究发现外膜蛋白基因omp25、omp33-36、CarO 相对表达量的平均水平较对照菌株呈现明显升高，并未发现文献报道表达显著降低的现象。本研究结果提示，外膜蛋白基因的表达在我院大部分鲍曼不动杆菌耐药中可能并未发挥作用。可能的原因是研究菌株来源存在地区差异，并且菌株所携带的其他耐药基因（OXA 酶、金属酶等）可能存在不同。

综上所述，本课题研究结果表明，外排泵adeB基因过度表达在鲍曼不动杆菌耐药中可能起着非常重要的作用；其余外排泵基因（adeJ、adeG、craA、abeM、amvA）和外膜蛋白基因（omp25、omp33-36、CarO）与在耐药菌的耐药机制中可能不起作用。不足之处是需要进一步研究其深层次耐药机制。因此，对于本院感染鲍曼不动杆菌的患者，充分了解其耐药的背景特征，有针对性选择抗生素进行治疗，例如使用替加环素治疗可能是比较好的选择。

【Author contributions】HUANG Yubo collected data，performed the experiments and wrote the article.ZHOU Yuqi revised the article and provided funding support.ZHENG Wenzheng collected data and performed the experiments.ZHU Jiaxin provided strains and methodology.YANG Hailing and WU Wenbin provided experimental equipment and performed the experiments.ZHANG Tiantuo designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.