UPLC-MS/MS同时测定酱卤制品中15种大环内酯类抗生素

梁婷婷,曾云想,柯建赛,蒋武毅

(1.温州市农产品检验测试中心,浙江 温州 325000; 2.苍南县质量技术监督检测院,浙江 苍南 325800;3.浙江省酱卤休闲食品质量检测中心,浙江 苍南 325800)

大环内酯类抗生素是一类含有12～16个碳原子组成内酯环化学结构的抗菌药。目前根据大环结构含碳母核数量的不同,可分为14元环类、15元环类和16元环类3类[1]。由于其有广谱抗菌作用,除临床应用外还广泛应用于兽药中,常用于防治畜禽呼吸道及胃肠道感染等疾病;在低浓度时其还可作生长促进剂使用[2-3],因此在畜牧养殖业得到广泛使用[4-6]。对抗生素的滥用或违规使用容易导致食品中兽药残留,其主要可引起人体胃肠道的不良反应,造成肝肾功能损伤及导致耐药菌株扩散。为保障食品安全,各国政府均对动物源性食品中大环内酯类药物的最大残留限量作出相关规定[7-9]。因此,开展动物源性食品中大环内酯类药物残留的定量分析方法研究具有现实意义。当前对于10种以上同类抗生素同时检测方法较少,然而在实际养殖过程中可能同时使用多种抗生素,因此建立一种能够同时检测多种大环内酯类抗生素的联合检测方法尤为重要。本研究前处理操作简单,缩短提取时间,回收率稳定,灵敏度高,能够对低浓度的样品进行很好的定性确认;另外,建立同时测定15种大环内酯类抗生素的方法,能满足对该类药物残留限量的检测要求。同时为酱卤禽畜肉食品的检测及评估其抗生素残留情况提供一个操作简单、回收率稳定的方法,并为未来研究多类抗生素的联合检测方法提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1290-6460型超高效液相色谱-串联质谱仪;瑞典Biotage固相萃取仪;KH3200B型台式超声波清洗器;Direct-Pure UP型纯水机;梅特勒LE204E/02型分析天平;IKA旋涡混合器、固相萃取柱。

大环内酯类药物标准溶液:林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、伊维菌素、地红霉素(纯度均≥92%,Dr.Ehrenstofer公司,德国);甲醇、甲酸、乙腈、正己烷(HPLC级,德国Merck公司)。

15种大环内酯类药物标准储备溶液:准确量取适量大环内酯类标准物质,以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成质量浓度为1.00 mg/mL的单标准储备液,在-18 ℃下保存;15种大环内酯类药物标准使用溶液:取低温下标准储备液,放置至室温,准确量取100 μL的标准储备液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度线,配制成1.00 mg/L的单标准使用液,在-18 ℃下保存。使用前用乙腈配制成2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 ng/mL 15种物质混合的标准工作溶液,现配现用。

酱卤制品:酱卤制品是畜禽肉及可食副产品加调味料和香辛料,以水为加热介质煮制而成的一大类熟肉制品。

1.2 试验方法

参考SN/T 1777.2-2007进行样品制备,取预包装的酱卤食品中可食用部分用研磨机充分粉碎并搅拌均匀,装入玻璃容器中,密封,试样于-18 ℃保存。

称取粉碎均匀后的固体试样5 g(精确到0.001 g)置于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL 1%甲酸乙腈(V/V),旋涡振荡器振荡2 min,超声提取10 min,以8000 r/min冷冻离心3 min,移取上清液,残渣用10 mL乙腈再次提取,合并2次提取液,将提取液用20 mL正己烷净化后移取下层溶液,将下层液过5 mL水、5 mL甲醇预淋洗的HLB固相萃取柱,用3.0 mL甲醇洗脱2次,收集洗脱液。洗脱液于75 ℃水浴氮吹至近干,甲醇定容至1.00 mL,过0.22 μm微孔滤膜供液质分析。

1.3 数学模型

C=c×V/m

式中:C为测试样中被测组分的残留量(μg/kg);c为回归方程拟合得到的样品溶液的浓度(ng/mL);V为测试样定容体积(mL);m为测试样溶液中的样品质量(g)。

1.4 仪器工作条件

1.4.1色谱条件

Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm),流动相:A为0.1%(体积分数,下同)甲酸水溶液,B为甲醇;柱温35 ℃,进样量10 μL。流动相梯度洗脱程序:0～3 min,5%～10%B;3～5 min,10%～30%B;5～8.5 min,30%～60%B;8.5～12 min,60%～95%B;12～13 min,95%～5%B,13～16 min,5%B。流量0.3 mL/min。

1.4.2质谱条件

配制1.0 μg/kg的大环内酯类药物单标准溶液,在正离子模式下,分别进行一级质谱扫描(Q1扫描)、二级质谱扫描(子离子扫描)和多反应监测(MRM)扫描。在Q1扫描中找出每个化合物的母离子,在子离子扫描中找到3～4个响应较大的子离子,最后在MRM扫描下优化CE和DP参数,选择响应较高、稳定性好的1个子离子作为定量离子。优化的质谱参数见表1。

表1 质谱参数

电喷雾电离正离子模式(ESI+);质谱扫描方式:多反应离子监测(MRM);脱溶剂气:氮气;碰撞气:氩气;干燥气流量:10 L/min;干燥气温度:350 ℃;毛细管电压:3.0 kV;喷雾压力:207 kPa。其他质谱参数见表1。其中标*为定量离子。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1色谱柱优化

分别选择Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)和Waters Acquity BEH-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)进行分离试验比对。结果表明,使用前者进行分离,各化合物的峰形和信噪比较好。这可能是由于大环内酯类药物中含有叔氨基结构,而不会与Agilent ZORBAX SB C8固定相中二异丙基之间产生非特异性相互作用,所以不会在柱上出现峰形拖尾,可以改善峰形。因此,最终选择Agilent ZORBAX SB C8(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)作为分离柱。

2.1.2流动相优化

分别选择甲醇和乙腈作为有机相进行分离效果对比,结果表明乙腈作为洗脱溶剂时,交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素不能有效分离,出现重叠峰。而选择甲醇作为洗脱剂时,各化合物离子化效率高,峰形较好,灵敏度较高。

确定甲醇作为有机相洗脱剂后,水相洗脱剂分别选择0.1%甲酸水溶液(V/V)和0.1%乙酸铵水溶液(V/V)进行对比,在相同的液相色谱分离程序下,考察15种化合物的出峰情况。结果表明,0.1%乙酸铵水溶液能改善峰形,但0.1%乙酸铵水溶液容易在Agilent ZORBAX SB C8柱内形成盐粒堵塞色谱柱,导致试验重现性较差。所以试验最终选择0.1%的甲酸水溶液-甲醇作为流动相洗脱剂。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1提取液的选择

大环内酯类化合物特性为弱碱性,易溶于酸性水溶液和极性溶剂。本试验样品蛋白质、油脂和糖含量较高,由于高浓度乙腈有蛋白沉淀作用,对糖和油脂溶解度较小,低浓度的甲酸可创造酸性环境提高弱碱性药物大环内酯类的提取率,所以试验选用1%甲酸乙腈(V/V)作为提取溶剂。

2.2.2提取条件的选择

由于试样中油脂部分在低温条件下可凝固,并且低温条件下分层效果更好,不易堵塞净化柱,且能缩短前处理时间。因而参考现行国标GB/T 20762-2006等[7-8]在样品制备过程中设定的离心机转速3000 r/min,时间6 min的试验条件。本研究将离心机转速调整为8000 r/min,-2 ℃下冷冻离心3 min。

2.3 线性关系、检出限与定量限

用大环内酯类药物标准储备液配成一系列混合标准使用液,在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定,以目标化合物定量离子的峰面积为纵坐标,相应的质量浓度为横坐标进行标准曲线的绘制。以3倍信噪比(S/N>3)所对应的待测物的浓度为样品的检出限(LOD),以10倍信噪比(S/N>10)所对应待测物的浓度为定量限(LOQ),结果见表2。本方法的检出限、定量限均低于国标中的检出限和定量限,并且能够同时对多种低浓度大环内酯类药进行很好的定性确认,满足对该类药物残留限量的检测要求。

表2 15种抗生素线性回归方程、线性范围、相关系数(r2)、检出限和定量限

2.4 方法的回收率和精密度

选取经检测而未检出这15种抗生素的鸡胸肉样品作为空白样品,用空白样品做添加回收和精密度试验。取空白样品鸡胸肉中可食用部分用研磨机充分粉碎并搅拌均匀,称取粉碎均匀后的固体试样5 g(精确到0.001 g)置于50 mL聚丙烯离心管中,向离心管中分别添加0.10,1.00,10.00 mg/kg低中高三个浓度的标准溶液后,按照1.2试验方法进行提取、离心、过柱;最后按1.4仪器工作条件测定结果,分析结果表明分析物的平均回收率为89.2%～101.5%;对每一浓度水平分别做6次平行测定,相对标准偏差为0.9%～3.6%,结果见表3。方法回收率和精密度良好,能满足检测的要求。

2.5 不同基质样品的加标试验

分别选取经检测不含15种抗生素的鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉等4种样品作为研究对象,在添加1.00 mg/kg待分析物下,按照1.2试验方法进行提取、离心、过柱,按1.4仪器工作条件测定结果,同一浓度水平进行6次平行试验。结果见表4,4种基质样品中待测物的平均加标回收率在80%～120%范围内,RSD在10%以内,说明本方法具有良好的实用性(表4)。另外,试验结果显示,在猪肉和羊肉试验中回收率普遍低于鸡肉和牛肉中的回收率,其中在猪肉中替米考星、克拉霉素和羊肉中替米考星、克拉霉素、麦迪霉素的相对标准偏差高于5%,可能因这两类肉制品中的脂肪含量较高而对回收率有一定的影响。

表4 4种基质样品精密度与回收试验结果(n=6)

3 结论与讨论

本文研究超高效液相色谱-串联质谱法同时测定酱卤畜禽肉中15种大环内酯类抗生素的方法,对《动物源性食品中大环内酯类抗生素残留测定方法》(SN/T 1777.2-2007)及《畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20762-2006)进行方法优化,缩短检测时间,增加检测克拉霉素、阿奇霉素、麦迪霉素、伊维菌素、地红霉素等5种抗生素种类。经试验研究发现,选用Agilent ZORBAX SB C8可以消除色谱峰拖尾,改善峰性;流动相选取0.1%的甲酸水溶液-甲醇溶液时,可以防止盐化堵塞色谱柱;对提取方式优化,使用超声提取,固相萃取可以有效净化提取液,减轻基质效应。结果表明:15种抗生素目标物方法检出限在0.1～0.6 μg/kg,相关系数≥0.9994,回收率在82.7%～101.5%之间,RSD%为0.9%～6.2%。该方法能够对低浓度的样品进行很好的定性确认,满足对该类药物残留限量的检测要求。本研究使用固相萃取法(SPE)提取,目前人们探索了多种SPE新型技术,分子印迹固相萃取及新型吸附剂萃取等。这些研究均表现出改进后的SPE技术在抗生素检测方面有着高灵敏度,但缺乏对大环内酯类抗生素的专项研究,为使SPE法在检测大环内酯类抗生素中发挥更好的作用,需要进一步研究新型材料对大环内酯类抗生素的吸附性能。同时本试验中对15种大环内酯类抗生素的提取方法相较国标有变化,但没有就两种提取工艺的优缺点进行深入对比,也没有对比两种提取法对提取率的影响。后续工作将是围绕这两种提取工艺进行条件优化,以筛选出提取率最高的提取条件。