骨质疏松动物模型构建进展与应用特点分析

李彦冉,闫盼盼,苗艳艳,苗明三

(河南中医药大学药学院,郑州 450046)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是骨量减少、微结构破坏和骨脆性增加的一种代谢性疾病,临床表现为腰背痛,病理特征为骨微结构损坏[1]。全球约有2 亿骨质疏松症患者,我国已超过9000 万例[2],患病率女性显著高于男性,50 岁以上女性发病率为32.1%[3-4],随着人口老龄化的加剧,骨质疏松症越来越受到大家的关注,并且骨质疏松症在世界慢性疾病中位居第三[5]。骨质疏松会导致骨组织钙化,疾病可引起骨骼疼痛,表现为慢性腰背疼痛,沿着脊柱向两侧扩散,导致患者椎体楔形改变,影响生活质量[6]。

临床上绝经后骨质疏松,一般年龄在50～ 70岁,多表现为骨形成与骨吸收的生化指标增高,70岁以上的老年性骨质疏松症患者,骨形成与骨吸收的生化指标多正常或低于正常范围[7]。新药药效的研究离不开动物模型的构建,高效的造模方法有利于提高造模成功率。本文通过对骨质疏松症模型的建立的优缺点及应用特点分析,不仅为造模提供理论依据与指导,还为新药研发提供思路。

1 常见动物模型的建立

1.1 去势骨质疏松模型

去势诱导包括卵巢或睾丸切除去势法,甲状旁腺切除法,其中通过手术切除动物的卵巢来模拟性激素分泌大幅减少而诱发骨质疏松,很好模拟雌激素水平下降是经典的去势骨质疏松模型。双侧卵巢摘除形成的骨质疏松大鼠模型可模拟雌激素缺乏时由于破骨细胞功能亢进和骨更新加快而导致的小梁骨过度丢失[8]。研究显示去卵巢后的大鼠雌激素缺乏使骨代谢处于负平衡状态,与绝经后妇女骨代谢变化相似[9]。该模型具有操作简单、重复性高、模型稳定的优势,但可能产生创伤应激反应。

1.2 药物诱导骨质疏松模型

常用糖皮质激素、链脲佐菌素、维甲酸诱导骨质疏松模型。糖皮质激素诱导骨质疏松模型,致使骨形成受损及骨折风险在几个月内以剂量依赖性方式增加[10]。糖皮质激素损害股骨骨小梁结构并降低其机械强度,诱导成骨细胞凋亡及骨形成减少和骨脆性导致骨质疏松。链脲佐菌素易受雌激素干扰[11],雄性更容易诱导细胞毒性破坏胰岛β 细胞。故常用SD 雄性大鼠单次腹腔注射60 mg/kg 链脲佐菌素诱导Ⅰ型糖尿病型骨质疏松模型。研究表明维甲酸诱导的骨质疏松小鼠骨组织和血清RANKL 分泌水平升高,OPG 在血清和骨组织中有下降趋势,同时OPG/RANKL 的比值降低[12]。该模型避免创伤应激,重复性强,更适应临床,但药物本身具有不良反应。

1.3 失用型骨质疏松模型

因肢体局部或全身制动,失重导致体内骨形成和骨吸收平衡被破坏是失用型骨质疏松的造模方法。坐骨神经或脊髓切断术、臂丛神经切除术、踝尾固定法是常用的失用型骨质疏松模型。研究表明处于生长期的啮齿动物对于失重法更为敏感[13]。腿尾固定所致的失用型质疏松不仅和机械刺激缺乏有关,同样与局部血流量减少有关[14]。OPG、RANKL 及RANK 通路在骨骼肌组织中存在表达,影响骨骼肌的功能和质量[15]。该模型具有可逆性且创伤面积小,但周期长,容易引起并发症。

1.4 老年型骨质疏松模型

D-半乳糖致雄性鼠骨质疏松是一个较为实用的研究老年男性骨质疏松的动物模型[16]。一般选用18～ 24 月龄的动物或SAMP6 小鼠快速老化模型小鼠构建老年型骨质疏松模型,其伴随着中老年的自发性骨折倾向。该模型可以很好地模拟骨质流失的过程,但存在个体差异。

1.5 基因诱导骨质疏松模型

骨质疏松地发生是由多个遗传因素和环境因素共同决定,研究显示FKBP8 基因蛋白表达敲除和OPG 基因敲除构建骨质疏松小鼠效果更加稳定[17-18]。基因诱导模型稳定,从分子细胞角度出发,目的性针对性更强,缩短实验周期,但花费较高,实验操作较复杂。

2 中医病证结合动物模型造模方法

现代中医药造模广泛应用临床研究,病证结合模型反映中医与现代医学的结合,同时也丰富了动物疾病模型。骨质疏松在中医临床上有不同分型,肾阳虚证是主要的证候表现。病证结合可增加模型稳定性和可靠性,是研究的热点,同时也反映用药个体差异化。具体如表1 所示。

表1 病证结合动物模型Table 1 Combination of symptoms and animal models

3 传统造模与中医病证结合造模的比较

传统中医上并没有骨质疏松症的病名,临床表现归属于骨痿、骨痹、骨枯等范畴,其发病原因与年龄及性别、劳逸失度、情志失和等因素有关[27],中医认为“肾主骨”脾虚肾亏导致骨质疏松症[28],肾精亏虚,络气虚滞,髓亏骨枯是骨质疏松的病机特点[29]。中医病证结合造模一般在传统造模的基础上,以中医理论为基础,复制出具有中医临床症状的模型。随着学者对中医药研究的深入,病证结合造模的方法越来越重要。病证结合就是在传统造模诱发疾病前后,引入不同的症候且符合中医理论。但模型建立究竟先证再病,还是先病再证还是存在很大的争议。人体骨骼的生长发育与脾肾息息相关,有学者发现脾肾阳虚是骨质疏松症的主要证型[30]。多因素造模是病证结合的特点之一,可以很明显体现动物的个体差异化,同时符合中医同病异症的观念。如切除大鼠卵巢后注射氢化可的松及番泻叶灌胃,同时造饮食失节伴劳倦过度的方法制备脾肾阳虚型骨质疏松症模型[23],能够更加全面准确的构建模型,服务临床研究。中医上的“症”能更好的模拟患者的致病因素及生存状态,更贴切临床治疗。中医药动物模型既有西医的病理特征,又有中医证候的表现,很好的完成中西医相结合,有助于推动病症结合动物模型的完善。

4 模型的应用特点

4.1 实验动物种类

实验常用SD 雌性大鼠和Wistar 雌性大鼠构建骨质疏松模型,大鼠容易饲养、造模周期较短、可控性强、繁殖周期短,能较好地模拟骨质疏松症发病情况;成年雌性绵羊自发性排卵且激素分泌规律,与成年女性激素分泌时间和数量及排卵周期相似[31],而且具有和人相似脊柱结构能最大程度反映人体的机能状态。但是由于造模周期较长,价格较贵,应用较少。实验动物选择及其优缺点,如表2 所示。

表2 动物品系分布Table 2 Animal strain distribution

4.2 实验动物性别

实验动物以雌性居多,小鼠年龄大多在3～ 6月龄,大鼠在8 周龄。动物造模常使用雌性动物,雌激素对破骨细胞的抑制作用减弱,导致骨吸收功能增强,骨吸收与骨形成平衡被打破,容易导致骨质疏松[32]。骨质疏松与妇女绝经具有相关性,缺乏雌激素将造成骨质流失[33]。去势模型中雌激素水平在短时间内急剧下降,而人类围绝经期雌激素水平呈逐渐下降趋势[34]。虽去卵巢快速导致雌激素降低,但未能描述机体的动态变化。

4.3 实验动物成模时间

动物成模时间8～ 12 周频次较多,一般以大鼠和小鼠去势造模较多,体积小,便于操作,且成模效果稳定。绵羊、大白兔、犬、猴和树鼩成模时间长,但效果好。

4.4 动物实验阳性药使用情况

骨质疏松治疗主要包括骨形成促进剂、骨吸收抑制剂。雌二醇能有效地抑制去卵巢大鼠过高的骨转换,使骨小梁骨量增加,结构改善,松质骨的力学特征得到改善,是合适的阳性药物[35]。强骨胶囊能减少骨质疏松性骨折患者的骨折愈合时问,化解肾阳虚的证候,降低骨折风险,增加患者BMD[8]。左归丸能促成骨细胞增殖,和调节ERK1/2、Wnt/βcatenin 通路有关[36]。西药治疗是对患者病因进行治疗,如糖皮质激素、骨吸收抑制剂和骨形成促进剂;中药治疗是对证候进行治疗,如补骨脂、杜仲、淫羊藿、黄芪,具有强筋骨、补肾阳及补气血的作用。

4.5 动物模型检测指标

动物模型检测指标共3 大类:主要覆盖表观指标、生化指标和病理指标。骨密度病理指标[37]、骨组织形态计量学测定目前是临床上诊断骨质疏松症的金标准。现代医学动物模型是以实验室检测或病理形态学检测的诊断标准为依据[38]。

4.5.1 表观指标

表现为精神萎靡、行动迟缓、毛色发黄、失去光泽、体形消瘦、弓背严重、尿量增多、食少便溏等。

4.5.2 生化指标

血清碱性磷酸酶、血清骨钙素,钙是重要的骨矿物质元素,钙丢失和钙减少是引起骨密度下降导致骨质疏松的重要因素[39]。Ⅰ型前胶原N 端前肽是破骨细胞活性标志物;骨保护素是反映骨形成的关键因子;骨特异性碱性磷酸酶是反映骨形成和骨转换的特异性指标[40-41]。β 胶原降解产物是反映骨吸收的特异性敏感指标;骨钙素是骨重建的标志物[42]。碱性磷酸酶、骨钙素作为骨形成标志物,抗酒石酸酸性磷酸酶作为骨吸收标志物[43],对骨折具有一定的预后意义。骨转化过程中,钙磷代谢调节指标、细胞因子、骨吸收标志物和骨形成标志物等发挥着重要的调节作用[44]。

4.5.3 病理指标

主要包括骨密度、骨小梁数量、骨小梁间隔、骨小梁厚度、骨体积分数、骨小梁分离度、骨表面积和骨弯曲生物力学强度等。实验动物骨密度降低,骨质变差表明模型成功。Micro-CT 能够直观、立体地从空间结构上评价骨代谢形态学,揭露骨质疏松模型构建成功的情况和指导临床用药。

5 总结与展望

综上所述,去势骨质疏松及药物诱导骨质疏松模型是常见的造模方式。本文通过对多种建模方式、动物选择的优缺点及应用特点进行归纳总结,便于研究人员建立高效、稳定、完善的模型。骨质疏松的发病率与年龄的增长正相关[45],具有发病率高、依从性差、预后不佳等特点[46]。骨质疏松动物模型已广泛应用于病程进展及相关因子的表达研究、药物的干预研究、影响骨质疏松形成的因素研究等[47]。临床上仍缺乏安全、有效、成本低且可耐受的治疗方法,而动物模型又是临床研究的重要载体,故构建合适的动物模型,进一步验证药物药效机制的作用,为临床治疗骨质疏松症提供参考与指导。

中医药治疗骨质疏松具有独特优势,需进行大量动物研究。目前中医辨证及西医辨病相结合构建动物模型的研究较少,待进一步完善,建立更贴合临床病证的骨质疏松模型。本文通过对动物模型的分析希望能够揭示其发病的中西医内在机理、演变过程等,筛选出有效的治疗药物,为新药研究奠定基础。