基于NLRP3/ASC/Caspase-1 通路探讨真武汤改善脾肾阳虚型糖尿病肾病炎症损伤的机制

赵哲,陈光顺,白敏,靳玉秋,田萌媛,张延英,刘臻华∗,宋冰∗

(1.甘肃中医药大学,兰州 730000;2.甘肃省实验动物行业技术中心,兰州 730000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)为现代医学病名,临床表现主要为蛋白尿以及肾小球滤过率进行性降低,流行病学调查统计,全球糖尿病肾病患病率逐年上升,预计2030 年增加到5.78 亿,同时也是全球终末期肾病最主要的病因[1-3]。然而DN 发病机制复杂,其中炎症反应是目前DN 发病机制以及防治机制研究的重点领域[4]。Nod 样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)是一种重要的炎症调节剂,NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路被激活后加剧了促炎性细胞因子成熟和分泌,放大炎症反应,进而肾小管上皮细胞与肾小球足细胞发生损伤与焦亡,导致肾功能下降,加重肾组织的病理损伤[5-6]。截至目前,现代医学针对DN 中的临床治疗方法正处于瓶颈阶段[7-8]。中医药在治疗DN 具有多组分、多靶点协同的优势,在改善DN 的肾损伤中发挥着非常重要的作用,具有较好的疗效和安全性[9-11]。

真武汤出自张仲景的《伤寒论》,由附子、白术、茯苓、芍药、生姜五味药组成,具有培土制水、温阳利水等功效。现在临床研究表明真武汤可以抑制DN 患者机体炎症反应以及肾损害[12],网络药理学研究发现真武汤改善DN 与其调控炎性通路有关[13]。因此本研究在评价真武汤干预脾肾阳虚证DN 小鼠模型药效学的基础上进一步探讨真武汤调控NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路的作用,从分子水平方面揭示其治疗DN 的机制,为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

25 只SPF 级健康雄性db/m 小鼠,7 周龄,体重约为17 g,95 只SPF 级健康雄性db/db 小鼠,7 周龄,体重约为39 g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司【SCXK(京)2019-0010】。动物饲养于甘肃中医药大学实验动物中心【SYXK(甘)2020-0009】。饲养期间自由饮水,昼夜各半循环照明,相对湿度50%～ 60%,温度21～ 25℃。所有操作均经甘肃中医药大学动物实验伦理审查审批(2021-245)。

1.1.2 药物

真武汤组方:参考全国高等中医药院校规划教材《伤寒论选读》(第十一版)即:制附片15 g、茯苓45 g、白术30 g、白芍45 g、生姜45 g,购自甘肃中医药大学附属医院,经甘肃中医药大学李越峰教授鉴定为正品。厄贝沙坦片(批号220226JA)购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器

氢化可的松注射液(国药集团容生制药有限公司,2008202);T(江苏菲亚生物科技有限公司,2205M78);T3 (江苏菲亚生物科技有限公司,2205M91);T4 (江苏菲亚生物科技有限公司,2205M97);E2 (江苏菲亚生物科技有限公司,2205M81);IL-1β(江苏菲亚生物科技有限公司,2208M21);IL-18(江苏菲亚生物科技有限公司,2209M65);尿蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,A035-2-1);NLRP3 多克隆一抗(Abcam,GR3425661-4);ASC 多克隆一抗(GeneTex,822204975);Caspase-1 多克隆一抗(Abcam,#J2021);GAPDH 内参(ImmunoWay,B1501);山羊抗兔IgG 抗体(博士德生物工程有限公司,BST13C23C54)。

酶标检测仪(BioTek,CYTATION1,美国);高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司,SCIENTZ-48,中国);高速低温离心机(上海天美科学仪器有限公司,CT14RD,中国)。

1.2 方法

1.2.1 模型复制

将25 只db/m 雄性小鼠作为空白对照组,95 只雄性db/db 小鼠参考文献[14-15]采用生大黄水煎液以及灌服氢化可的松注射液复制脾肾阳虚证模型,持续造模14 d,并进行模型评价。将造模成功脾肾阳虚型糖尿病肾病小鼠分为:模型对照组,真武汤高、中、低剂量组,厄贝沙坦组,每组至少15 只。

1.2.2 药物制备与给药

先将制附片置于陶瓷中药煎锅内煎煮90 min,再将其余药物置于锅内混合煎煮30 min(煎煮两次),合并两次药液浓缩至相当于生药4.625 g/mL,灭菌后-20℃冰箱保存备用。根据人和小鼠体表面积系数计算[16],真武汤高、中、低剂量组给药剂量分别为33.8、16.9、8.45 g/(kg·d),厄贝沙坦灌胃25 mg/(kg·d),持续治疗8 周。

1.2.3 一般状况和中医证候积分

于给药结束后观察各组小鼠中医证候。参照文献[17]拟定脾肾阳虚型小鼠证候积分评量表(表1),从小鼠精神状态、毛发、粪便等项目评价各组小鼠给药后对脾肾阳虚证候的改善情况。

表1 脾肾阳虚型DN 观察及评分标准Table 1 Observation and scoring criteria for DN with spleen-kidney yang deficiency type

1.2.4 采集及标本提取

于给药末次,将各组小鼠分别置于代谢笼中,自由饮水,收集24 h 尿液,并记录尿量,并将收集好的尿液离心后,分离上清液,冻存以备后续检测。

于末次给药后,各组小鼠禁食不禁水12 h,常规消毒后,将小鼠麻醉后进行股动脉取血,静置30 min,进行低温离心(4℃、3000 r/min,15 min),冻存以备后续血清检测。取血后,迅速取下肾组织,称量肾组织,取单侧肾组织置于4%多聚甲醛溶液内,用于HE 染色;剩余组织置于超低温冰箱(-80℃)冻存,以备后续检测。

1.2.5 指标检测

(1)Ucr、FBG 的检测

甘肃中医药大学生理实验室全自动生化仪检验Ucr 的含量,给药末次使用全自动电子血糖仪检测各组小鼠尾静脉FBG。

(2)尿蛋白定量检测

取出各组小鼠末次尿液离心后,收集上清,严格按照生化试剂盒说明书检测各组小鼠尿液中尿蛋白的浓度,根据各组小鼠尿蛋白浓度乘以相对应的尿量,计算出各组小鼠24 h UTP 含量。公式:尿蛋白定量=24 h 浓度× 24 h 尿量。

(3)肾组织T、T3、T4、E2、IL-1β、IL-18 的含量测定

各组小鼠肾组织匀浆后,离心(3000 r/min,20 min),取离心上清。采用ELISA 法检测各组小鼠肾组织T、T3、T4、E2 和炎症细胞因子IL-1β、IL-18的含量,在450 nm 波长依序测量各孔OD 值。

(4)肾组织HE 染色

将浸泡在4%多聚甲醛溶液的肾组织取出,进行HE 染色,在光学显微镜下采集图像。

(5)肾组织NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达水平测定

提取小鼠肾组织总蛋白,用BCA 法检测蛋白浓度,加入适量Buffer,在95℃金属浴煮10 min 变性备用。每空加入等量蛋白样品进行电泳,转移至PVDF 膜上,封闭,加入对应的NLRP3(1 ∶1000)、ASC(1 ∶1000)、Caspase-1(1 ∶1000)一抗,4℃孵育摇床过夜,用TBST 充分漂洗后加入二抗,室温孵育,ECL 法显色,使用Image J 软件分析条带灰度值。

(6)肾组织NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 表达水平测定

取适量小鼠肾组织,提取总RNA,检测RNA 浓度,以GAPDH 作为内参基因进行PCR 扩增。扩增条件:95℃预变性,三步循环法反应(95℃10 s,60℃20 s,72℃20 s),45 个循环。得到实验所需Ct 值,以2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。引物序列由宝生物工程(大连)有限公司设计合成,各引物序列见表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件进行统计数据分析。若实验数据符合正态分布,则计量资料用平均值±标准差()表示,各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时各组间比较采用LSD 法进行事后检验,方差不齐时各组间比较采用塔姆黑尼T2 法进行事后检验;若实验数据不符合正态分布,则选择使用中位数和四分位数间距表示,组间比较采用秩和检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠一般状态与证候积分的影响

空白对照组小鼠精神状态良好,皮毛光洁、色泽正常,进食正常,体重稳步增长,二便调畅,垫料干燥。模型对照组小鼠毛发枯槁稀疏,灰暗无光,精神倦态,反应迟钝,活动迟缓,扎堆倦卧,大便稀溏呈糊状,与空白对照组相比,模型对照组小鼠证候积分显著性升高(P<0.05)。与模型对照组相比,真武汤高、中剂量组小鼠精神活动明显好转,垫料轻度潮湿,蜷缩现象较少。其中,以真武汤高剂量组证候积分显著下降(P<0.05),见表3。

表3 真武汤对各组小鼠中医证候积分评价的影响(,n=10)Table 3 Effect of Zhenwu Decoction on the evaluation of TCM evidence points in each group of mice (,n=10)

表3 真武汤对各组小鼠中医证候积分评价的影响(,n=10)Table 3 Effect of Zhenwu Decoction on the evaluation of TCM evidence points in each group of mice (,n=10)

注:与空白对照组相比,∗P <0.05;与模型对照组相比,#P <0.05。(下表同)Note.Compared with blank control group,∗P <0.05.Compared with model control group,#P <0.05.(The same in the following tables)

2.2 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠脾肾阳虚相关指标的影响

与空白对照组相比,模型对照组T、T3、T4 含量明显降低,具有显著性差异性(P<0.05),E2 含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05);与模型对照组相比,真武汤高、中、低剂量组小鼠肾组织中T、T3、T4 含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05);真武汤高、中、低剂量组小鼠肾组织中E2 显著降低(P<0.05),见表4。

表4 真武汤对各组小鼠脾肾阳虚相关指标的影响(,n=8)Table 4 Effect of Zhenwu Decoction the indexes related to spleen and kidney yang deficiency in each group of mice (,n=8)

表4 真武汤对各组小鼠脾肾阳虚相关指标的影响(,n=8)Table 4 Effect of Zhenwu Decoction the indexes related to spleen and kidney yang deficiency in each group of mice (,n=8)

2.3 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠FBG、Ucr、24 h UTP 的影响

与空白对照组相比较,模型对照组小鼠FBG、24 h UTP 含量显著升高(P<0.05),Ucr 含量显著下降(P<0.05)。与模型对照组相比较,真武汤高、中、低剂量组及厄贝沙坦组24 h UTP 含量显著降低(P<0.05),Ucr 含量显著升高(P<0.05),见表5。

表5 真武汤对各组小鼠FBG、Ucr、24 h UTP 的影响(,n=10)Table 5 Effect of Zhenwu Decoction on FBG,Ucr,and 24 h UTP protein in each group of mice (,n=10)

表5 真武汤对各组小鼠FBG、Ucr、24 h UTP 的影响(,n=10)Table 5 Effect of Zhenwu Decoction on FBG,Ucr,and 24 h UTP protein in each group of mice (,n=10)

2.4 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠肾组织HE 染色观察结果

各组小鼠肾组织HE 染色(800 倍镜下)结果显示,空白对照组小鼠肾组织表面被膜由厚薄均匀的致密结缔组织构成,皮质髓质分界明显;皮质中肾小球分布均匀,肾小管上皮细胞排列整齐规则,髓质未见明显异常;未见明显的炎性改变。与空白对照组小鼠肾结构相比,模型对照组小鼠肾小球体积增大,系膜区弥漫性增宽,肾小囊部分粘连,肾组织可见多量肾小管上皮细胞水样变性,胞质疏松淡染;偶见肾小管上皮细胞胞质空泡化。各治疗组小鼠均明显可见胞质疏松淡染,肾小球轻度肥大,少见或不见肾小管上皮细胞水样变性,病理检测结果显著优于模型对照组,见图1。

图1 真武汤对各组小鼠肾组织病理变化的影响(HE 染色)Figure 1 Effect of Zhenwu Decoction on the histopathological changes of kidney in each group of mice (HE staining)

2.5 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠肾组织IL-1β、IL-18 含量的影响

空白对照组相比,模型对照组小鼠肾组织IL-1β、IL-18 的含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比,真武汤高、中剂量组及厄贝沙坦组小鼠肾组织IL-1β、IL-18 含量显著降低(P<0.05),结果见表6。

表6 真武汤对各组小鼠IL-1β、IL-18 的影响(,n=6)Table 6 Effect of Zhenwu Decoction on IL-1β and IL-18 in each group of mice(,n=6)

表6 真武汤对各组小鼠IL-1β、IL-18 的影响(,n=6)Table 6 Effect of Zhenwu Decoction on IL-1β and IL-18 in each group of mice(,n=6)

2.6 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠肾组织NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 表达水平的影响

与正常对照组比较,模型对照组小鼠肾组织中NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 表达显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,真武汤高、中、低剂量组小鼠NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 表达显著降低(P<0.05),见表7。

表7 真武汤对各组小鼠肾组织NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路mRNA 表达的影响(,n=3)Table 7 Effect of Zhenwu Decoction on mRNA expression of NLRP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway in kidney tissues of various groups of mice(,n=3)

表7 真武汤对各组小鼠肾组织NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路mRNA 表达的影响(,n=3)Table 7 Effect of Zhenwu Decoction on mRNA expression of NLRP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway in kidney tissues of various groups of mice(,n=3)

2.7 真武汤对脾肾阳虚型DN 小鼠肾组织NLRP3、ASC 及Caspase-1 蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比,模型对照组小鼠肾组织NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达显著上调(P<0.05);与模型对照组相比,真武汤高中低剂量组NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达水平显著下调(P<0.05),见图2,表8。

图2 真武汤对各组小鼠肾组织NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量的影响Figure 2 Effect of Zhenwu Decoction on the relative expression of NLRP3,ASC and Caspase-1 protein in kidney tissues of mice in each group

表8 真武汤对各组小鼠肾组织NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路关键蛋白表达的影响(,n=3)Table 8 Effect of Zhenwu Decoction on the expression of key proteins of NLRP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway in kidney tissues of various groups of mice(,n=3)

表8 真武汤对各组小鼠肾组织NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路关键蛋白表达的影响(,n=3)Table 8 Effect of Zhenwu Decoction on the expression of key proteins of NLRP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway in kidney tissues of various groups of mice(,n=3)

3 讨论

DN 是糖尿病(diabetes mellitus,DM)临床常见的慢性并发症之一,多无明显症状,临床以持续性蛋白尿和肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)进行性下降进行诊断,中医并无“糖尿病肾病”病名,根据其临床症状将其归属于“水肿”“尿浊”以及“虚劳”等范畴,主要病机为本虚标实。随着DN 的发展,正气渐耗,脏腑功能衰退,气血阴阳虚衰,致使DN 的发病后期多发展至脾肾阳虚[18-19]。本实验采用db/db 小鼠(自发糖尿病肾病模型)为研究对象,采用苦寒泻下法+氢化可的松灌胃复制脾肾阳虚型DN 动物模型,大黄苦寒泄降,重在泄热导滞,作用强烈,素有将军之称,泻下作用强,能耗伤脾胃;氢化可的松作为外源性皮质激素类药物,正在短期干预后可以抑制肾上腺胆固醇转化为激素过程中的相关蛋白表达,进而降低肾上腺皮质激素释放,减少皮质醇、皮质酮的产生和分泌,出现中医学“肾阳虚”的表现[20]。雄性动物中T、T3、T4、E2 的含量的变化可作为肾阳虚动物模型常用的微观指标[21-22],反应“下丘脑-垂体-甲状腺”轴和“下丘脑-垂体-性腺”轴的功能,在肾阳虚动物模型中T、T3、T4 有不同程度的降低[23]。db/db 小鼠是由于瘦素受体基因突变引起的T2DM 小鼠,并是当前T2 DN 研究中应用较为广泛的动物模型[24],并在16～ 20 周龄时出现精神萎靡、大便稀溏、体表温度下降等表现,符合脾肾阳虚的症候特点[25]。

根据DN 的临床特点,国医大师严倩华认为DN的病机之本为脾肾亏虚,在治疗时以健脾补肾为主[26];国医大师张琪教授认为难治性肾病出现脾肾亏虚者,以振奋少阴肾阳以祛水散霾方为治本之法,方选用真武汤加减以治疗[27],大量临床研究表明真武汤能显著改善DN 患者肾功能,延缓DN 病理进展[28-31]。现代研究发现真武汤活性有效成分能够有效抑制DN 肾组织炎症反应,改善DN 肾功能损伤,如:芍药中的白芍总苷可以减少DN 患者的白蛋白尿以及降低患者血清MCP-1 和TNF-α 等水平,抑制炎症反应,并且TGP 与氯沙坦联合治疗比单用氯沙坦更有效地改善了DKD 患者的尿白蛋白排泄率、血肌酐和血脂[32]。茯苓酸可以降低急性肾损伤小鼠的血清肌酐和血尿素氮,并改善肾病理损伤[33]。亦有研究表明茯苓有效成分可以通过抑制氧化应激,从而减轻肾纤维化和足细胞的损伤[34]。姜黄素具有多种生物学特性,其中可以调节足细胞凋亡和自噬功能障碍来抑制DN 小鼠肾细胞凋亡减缓DN 的进展[35]。白术多糖可改善高糖诱导的肾小球足细胞凋亡[36]。本实验通过给予不同剂量真武汤干预脾肾阳虚型db/db 小鼠模型,结果发现,模型对照组小鼠出现毛发枯槁稀疏,灰暗无光,证候评分升高。且与空白对照组相比,模型对照组小鼠血清中T、T3、T4 的含量显著下降,E2 含量显著上升,模型对照组小鼠FBG、24 h UTP 较空白对照组均显著升高,Ucr 显著降低,HE 染色出现肾小球肥大,肾小球系膜和基底增厚明显。经过给药后,各组小鼠精神活动明显好转,证候积分减少,血清T、T3、T4 的含量均有不同程度的上升,E2 含量有不同程度的下降,且各给药组小鼠24 h UTP 显著降低,Ucr 显著升高,肾组织病理可见胞质疏松淡染,少量肾小管上皮细胞水样变性。以上结果提示,真武汤可以减轻脾肾阳虚证DN 小鼠肾功能损伤,改善肾病理改变。

糖尿病肾病的发生、发展与炎症细胞因子的产生失调密切相关,NLRP3 炎症小体可通过NLRP3/ASC/Caspase-1 通路促进炎症细胞因子的释放及活化并对免疫做出反应[37-39]。NLRP3 炎症小体作为高水平葡萄糖、尿酸、游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)等代谢危险信号的传感器[40],当机体糖脂代谢紊乱时触发NLRP3 蛋白酶体活化,NLRP3 炎症小体被激活时促进接头蛋白-凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)表达,调节水解pro-caspase-1 产生Caspase-1(cysteinyl aspartatespecific protease-1,Caspase-1),进而将细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18 分别转化成IL-1β 和IL-18,从而扩大炎症反应和免疫细胞的激活,诱导机体引起过度炎症反应和组织损伤,加重DN 的病理进程[41-44],并通过抑制NLRP3 的表达,可以减少IL-1β 和IL-18 的释放,从而减轻高糖诱导的小鼠足细胞损伤和DN 小鼠肾损伤[45]。本研究发现,与空白对照组小鼠相比,模型对照组小鼠肾组织NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路mRNA 及相关蛋白表达量显著升高,小鼠肾组织中IL-1β、IL-18 的含量显著升高;与模型对照组相比,真武汤高、中、低剂量组对上述蛋白的表达有明显的改善作用,并且各给药组小鼠肾组织中IL-1β 和IL-18 的含量显著降低。以上结果提示,真武汤能够抑制NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路的激活以及改善DN 小鼠炎症,从而减轻肾病理损害。

综上所述,本研究基于脾肾阳虚证db/db 模型小鼠,发现真武汤能明显改善模型小鼠一般情况及肾组织的病理学变化,其作用机制可能与降低NLRP3 炎症小体的表达,抑制机体炎症反应和NLRP3/ASC/Caspase-1 信号通路活化有关,为真武汤的临床应用提供了科学依据。但因炎症反应受多条通路的影响,其机制尚不完全明确,仍需进一步研究。