蟾蜍TNFRSF11b、TNFRSF9基因克隆及生物信息学分析△

苏岩，褚涵，余坤，潘瑞，3，叶陈娟，3，李军德，黄晓，5*，张恬*

1.重庆市中药研究院 重庆市中药资源学重点实验室，重庆 400065；

2.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；

3.中国中医科学院 中药资源中心 重庆分中心，重庆 400065；

4.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；

5.中药资源与中药化学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060

蟾蜍是蟾蜍科动物中华蟾蜍Bufo gargarizansCantor 或黑眶蟾蜍Duttaphrynus melanostictusSchneider 等的全体[1]，《有重要生态、科学、社会价值的陆生野生动物名录（国家林业和草原局公告2023 年第17 号）》将中华蟾蜍、黑眶蟾蜍列为国家“三有”保护动物[2]。《中华人民共和国药典》2020年版规定，中华蟾蜍是蟾酥、干蟾及蟾皮等蟾蜍类药材的基原动物之一[3]，因其具有重要的药用价值，如治疗恶性肿瘤、心衰、各种感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、周围性面神经麻痹，止痛麻醉等而备受关注[4]。现代研究表明，蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物是蟾皮中具有抗肿瘤活性的主要成分，能抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、抗血管生成、诱导肿瘤细胞分化、逆转肿瘤细胞多药耐药等[5]。

肿瘤坏死因子（TNF）是一种可引起肿瘤组织出血坏死的蛋白类物质，且能在体外抑制和杀伤肿瘤细胞[6]。1962 年在黏质沙雷氏菌Serratia marcescens的多糖处理小鼠后收集的血清能够诱导肿瘤出现退行性现象实验中TNF首次被提出[7]。肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）作为一种重要的细胞因子受体，在皮肤、骨骼和淋巴器官的各种类型细胞之间提供关键信号，在多种类型的免疫效应细胞上具有独特的功能，能协同刺激用于治疗癌症的嵌合抗原受体（CAR）T细胞[8]。

基于本课题组转录组测序数据，得到TNFRSF11b、TNFRSF9序列信息，扩增其全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）片段后，利用生物信息学分析工具对其序列特征和功能进行预测，为后期TNFRSF11b、TNFRSF9基因功能的验证及其在TNF 炎症因子家族调控机制的相关研究提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

生长一致的成体中华蟾蜍3只，购买于安徽华润金蟾药业蟾蜍规范化养殖基地，经中国中医科学院中药资源中心李军德研究员鉴定为中华蟾蜍Bufo gargarizansCantor。对成体蟾蜍实施安死术（脑脊髓刺毁法）后，即刻采集蟾皮、耳后腺、肝脏等组织于-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.2 试剂

RNAprep pure 动物组织总RNA 提取试剂盒（批号：DP431）、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（DP219）、2×TaqPCR Master Mix（批号：KT201）均购于北京天根生物科技有限公司；PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录试剂盒（批号：RR047A）、克隆载体pMD18-T Vector（批号：6011）、PrimerSTAR® Max DNA Polymerase（批号：R045A）、PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase（批 号：R050A）、TB Green®Premix ExTaq™ Ⅱ（Tli RNase H Plus）试剂盒（批号：RR820A）均购于北京宝日医生物技术有限公司；RNA 保存液（北京百泰克生物技术有限公司）；大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；琼脂糖（Biowest公司）。

1.3 仪器

SW-CJ-1D型超净台（苏州净化设备有限公司）；Life Pro 型聚合酶链式反应（PCR）仪（杭州博日科技有限公司）；Mupid-2Plus 型琼脂糖凝胶电泳（日本Mupid 公司）；CT-14RD 型台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）；UPW-50S型超纯水机（北京历元电子仪器公司）；RAININ Pipet-One 型移液器（美国梅特勒-托利多公司）；Nano Drop 2000 型超微量核酸测量仪（赛默飞世尔科技公司）。

2 方法

2.1 总RNA的提取

称取-80 ℃冷冻保存的蟾皮组织约30 mg，置于装有液氮的研钵中迅速研磨、粉碎，按操作说明采用RNAsimple 提取总RNA。使用DNase Ⅰ进行DNA 消化，以Nano Drop 2000 型超微量核酸测量仪和1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的浓度和纯度。提取的蟾皮总RNA于-80 ℃保存。

2.2 cDNA模板合成和BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因PCR扩增

根据转录组数据中得到的BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因，分别于开放阅读框（ORF）前后约20 bp处设计特异性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全长扩增引物序列信息

以提取的RNA 为模板，按照反转录试剂盒操作说明合成第一链cDNA。BbgTNFRSF11b基因PCR 反应体系总体积为50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，正反向引物各2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR 反应条件为98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃冷却。BbgTNFRSF9基因PCR 反应体系总体积为50 μL：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each）4 μL，GXL DNA Polymerase 1 μL，正反向引物各2 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 27 μL。PCR 反应条件为98 ℃预变性5 min，98 ℃变性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃冷却。反应结束后，取PCR反应产物5 μL经1%琼脂糖电泳鉴定，DNA回收试剂盒回收PCR产物。

2.3 目的基因的克隆测序

将胶回收纯化的PCR克隆产物（目的基因）连接在pMD18-T Vector 载体上，取目的基因4.5 μL，pMD18-T Vector 0.5 μL，加入等量的SolutionⅠ 5 μL，16 ℃金属浴3～8 h。然后将连接产物全部转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，LB平板培养后做菌落PCR扩增（PCR反应条件同2.2项下），利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，选出阳性克隆进行菌液培养并测序。

2.4 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因生物信息学分析

利用通过NCBI ORF-Finder 在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测BbgTNFRSF 11b、BbgTNFRSF9cDNA 的ORF；利用NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序进行蛋白同源比对和保守结构域预测；用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）解 析 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 蛋白理化性质，使用InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）在线工具分析BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因编码蛋白的保守结构域论等电点和稳定性；SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 Swiss-model（http://swissmodel.expasy.org/）在线软件预测BbgTNFRSF 11b、BbgTNFRSF9 蛋白二级、三级结构；使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）及TMHMM Server 2.0（https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM，https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）进行信号肽和跨膜域分析；使用Expasy ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）及 NetPhos 3.1 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）在线软件分析亲水性和预测磷酸化位点；使用MEGA 7.0 软件构建BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的系统发育树，重复抽样次数选择500 以确保所构建进化树分支的稳定性。

2.5 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 的组织表达分析

根据中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的ORF 序列，使用Premier 5.0 软件设计实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的特异性引物（表2）。

表2 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因RT-qPCR扩增引物序列信息

RT-qPCR 反应体系为10 μL：模板1.0 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 5.0 μL，上下游引物各0.5 μL和ddH2O 3.0 μL。反应程序设定为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，共40 个循环；溶解曲线为94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s。重复3 次生物学试验，采用2-ΔΔCt方法计算基因的表达情况。最后利用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因克隆与测序

提取的中华蟾蜍蟾皮总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，可见28SrRNA和18SrRNA条带清晰明亮（图1）。超微量核酸测量仪检测吸光度（A），A260nm/A280nm为1.97，说明总RNA 的完整性好，浓度较高，可用于后续实验。

图1 总RNA琼脂糖凝胶检测图谱

以总RNA 反转录的cDNA 为模板，用BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9特征性引物进行退火温度梯度考察的PCR 全长扩增，将PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测得到2 条长度约为1300、1100 bp 的特异性条带，与转录组测序所得目的条带片段大小基本一致（图2）。

图2 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因扩增产物琼脂糖凝胶检测图谱

将回收纯化后的目的片段连接到PMD-18T 克隆载体上，转化到DH5α感受态细胞中，随机挑选12个单菌落，进行菌落PCR 扩增，挑选阳性克隆进行菌液培养并测序。

3.2 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因序列分析

利用DNAMAN 7.0 分析所得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列后发现，其与中华蟾蜍转录组测序所得TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段序列基本一致（图3）。ORF finder 结果显示，BbgTNFRSF11b的ORF 长为1233 bp，编码410 个氨基酸，BbgTNFRSF9的ORF 长为816 bp，编码274 个氨基酸。BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9的cDNA 序列及编码蛋白序列见图3。

图3 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9的cDNA序列及编码蛋白序列

通过NCBI 数据库中的Blastp 程序进行蛋白质比对，BbgTNFRSF11b序列与林蛙（Rana temporariaL.；XP_040210823.1）、高山倭蛙（Nanorana parkeriStejneger，L.；XP_018408849.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevisDaudin；XP_018123714.1）等动物的TNFRSF11b基因序列的同源性较高，其中与林蛙的TNFRSF11b基因序列相似性最高（60.41%），表明TNFRSF11b基因在物种间的相差性较大，同源性较差。利用MEGA 7.0 进行系统进化树分析，显示BbgTNFRSF11b基因与林蛙TNFRSF11b基因在一条进化枝上，说明它们的同源关系较近（图4）。

通过NCBI 数据库中的Blastp 程序进行蛋白质比对，BbgTNFRSF9序列与泥鳅（Engystomops pustulosusCantor；KAG8568725.1）、林蛙（XP_040182506.1)、非洲爪蟾（XP_018083418.1）等动物TNFRSF9 蛋白序列的同源性较高，其中与泥鳅的TNFRSF9基因序列相似性最高（65.81%），表明TNFRSF9基因在物种间相差较大。利用MEGA 7.0 进行系统进化树分析，显示BbgTNFRSF9基因与泥鳅TNFRSF9基因在一条进化枝上，说明它们的同源关系较近（图5）。

3.3 BbgTNFRSF11b基因编码蛋白质的特性分析

运用ProtParam 在线软件推测BbgTNFRSF11b蛋白质分子量为46.97 kDa，理论等电点为8.64，分子式为C2066H3297N563O610S37，总原子数为6573个，带负电荷的残基[天冬酰胺酸和谷氨酸（Asp+Glu）]总数为43，带正电荷的残基[精氨酸和赖氨酸（Arg+Lys）]总数为53。不稳定系数53.12，脂肪族指数为75.83，亲水性平均值（GRAVY）为-0.421，BbgTNFRSF9蛋白相对分子质量为67.874 kDa，理论等电点为5.12，分子式为C2490H4153N829O1035S175，总原子数为8682 个，带负电荷的残基（Asp+Glu）总数为0，带正电荷的残基（Arg+Lys）总数为0。不稳定系数46.58，脂肪族指数为29.79，GRAVY为0.793。

通过InterPro 和Blastp 对BbgTNFRSF11b 蛋白结构域分析显示，BbgTNFRSF11b编码的蛋白具有TNFR/NGFR、TNFRSF特征结构域和CRD1，2区段的单体小分子多肽，不存在保守结构域（图6）。

InterPro 和Blastp 对BbgTNFRSF9 蛋白 结构域分析显示，BbgTNFRSF9编码的蛋白具有TNFR/NGFR、TNFR 特征结构，不存在保守结构域（图7）。

利用DNAMAN V6 将中华蟾蜍与林蛙（XP_040210823.1）、高山倭蛙（XP_018408849.1）、非洲爪蟾（XP_018123714.1）、双条吻蚓（Rhinatrema bivittatumGuérin Méneville；XP_029447794.1）、热带爪蟾（Xenopus tropicalisGray；XP_002938025.2）5种动物TNFRSF11b蛋白序列多序列比对（图8），表明中华蟾蜍BbgTNFRSF11b序列同其他动物相似度不高，TNFRSF11b基因的保守性较低。

用 DNAMAN V6 将中华蟾蜍与泥鳅（KAG8568725.1）、林蛙（XP_040182506.1）、缟鬣狗（Hyaena hyaenaLinnaeus；XP_039090911.1）、非洲爪蟾（XP_018083418.1）、马来亚穿山甲（Manis javanicaDesmarest；XP_036855680.1）、长鳍领航鲸（Globicephala melasTraill；XP_030721651.1）5 种动物TNFRSF9蛋白序列多序列比对（图9），表明中华蟾蜍BbgTNFRSF9蛋白序列同其他动物相似度不高，TNFRSF9基因的保守性较低。

图9 中华蟾蜍BbgTNFRSF9蛋白与其他动物TNFRSF9蛋白的多序列比对分析结果

利用SignalP 4.0 Server 进行信号肽预测，SP 测得为“NO”，说明BbgTNFRSF11b 蛋白结构中不含信号肽。采用ProtScale 程序对此编码蛋白进行疏水性/亲水性分析，该蛋白整条肽链预测值为负值的氨基酸数量略高，其中第349 个氨基酸的亲水性最强，预测值为-2.756；第24个氨基酸的疏水性最强，预测值为2.467，结果显示蟾蜍BbgTNFRSF11b蛋白为亲水性蛋白（图10A）。采用TMHMM Server 2.0 对BbgTNFRSF11b 蛋白进行跨膜结构域预测，结果显示该蛋白位于膜外部的概率接近1，说明BbgTNFRSF11b 蛋白不存在跨膜区（图10B）。BbgTNFRSF11b 蛋白的磷酸化位点预测分析，发现该蛋白含有Ser 位点、Thr 位点、Tyr 位点分别为15、16、4个（图10C）。

图10 BbgTNFRSF11b蛋白亲水性/疏水性、蛋白跨膜结构域、蛋白磷酸化分析预测

检测BbgTNFRSF9的序列，信号肽I（SPI）测得为“0.985 8”，说明BbgTNFRSF9 蛋白含有信号肽，位点在23、24，采用ProtScale 程序对此编码蛋白进行疏水性/亲水性分析，该蛋白整条肽链预测值为正值的氨基酸数量略高，结果显示蟾蜍BbgTNFRSF9 蛋白为疏水性蛋白（图11A）。采用TMHMM Server 2.0 对BbgTNFRSF9 蛋白进行跨膜结构域预测，结果显示该蛋白位于膜外部的概率接近1，说明BbgTNFRSF9 蛋白不存在跨膜区（图11B）。BbgTNFRSF9 蛋白的磷酸化位点预测分析，发现该蛋白含有Thr位点（图11C）。

图11 BbgTNFRSF9蛋白亲水性/疏水性、蛋白跨膜结构域、蛋白磷酸化分析预测

利用在线分析工具SPOMA 进行二级结构预测，结果表明 BbgTNFRSF11b 蛋白由α螺旋（41.46%）、延伸链（10.98%）、β转角（5.12%）和不规则卷曲（42.44%）组成，其中，α螺旋和不规则卷曲是BbgTNFRSF11b 蛋白中最主要的结构元件（图12）。

图12 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b二级结构预测

利用在线分析工具SPOMA 进行二级结构预测，结果表明BbgTNFRSF9蛋白由α螺旋（16.36%）、延伸链（12.00%）、β转角（5.45%）和不规则卷曲（66.18%）组成，其中不规则卷曲是BbgTNFRSF9蛋白中最主要的结构元件（图13）。

图13 中华蟾蜍BbgTNFRSF9二级结构预测

使用SWISS-MPDEL 程序进行三级结构同源模建，对BbgTNFRSF11b（图14A）、BbgTNFRSF9（图14B）基因编码的蛋白质进行空间结构预测，从三级结构可以看出BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9均由α-螺旋与延伸链构成，这与二级结构预测结果基本一致。

图14 中华蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9三级结构同源模建

3.4 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因的组织表达分析

使用RT-qPCR 技术分析1 年龄期中华蟾蜍不同组织中BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的表达特征，结果显示，BbgTNFRSF11b基因在中华蟾蜍不同组织中均有表达，BbgTNFRSF9在肺和心中没有表达，表达量存在差异；2 个基因在耳后腺中表达量较高，其次是腹部皮肤；在肌肉中也有一定表达（图15）。

图15 BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因组织表达（,n=3）

4 讨论

以往研究表明，两栖动物的分泌物中含有多种活性物质，并具有多种相应的药理活性，例如抗炎、镇痛等[4]。本研究根据高通量测序得到中华蟾蜍转录组文库，成功克隆了中华蟾蜍TNF 家族的核心基因BbgTNFRSF11b和BbgTNFRSF9。生物信息学分析发现，BbgTNFRSF11b基因编码氨基酸序列含有TNFR/NGFR、TNFRSF的特征结构域和CRD1，2区段的单体小分子多肽[9]，在同源性研究过程中发现与林蛙的同源性最高，为60.41%，而BbgTNFRSF9在同源性研究者与泥鳅的同源性最高，为65.81%，说明TNFRSF11b、TNFRSF9在物种间的差异较大。与已知其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9蛋白的基本特性相比，中华蟾蜍TNFRSF11b 蛋白结构不含信号肽，TNFRSF9 蛋白结构则含信号肽，2 个基因都不存在跨膜区，BbgTNFRSF11b 为疏水性蛋白，BbgTNFRSF9 为亲水性蛋白，二级结构预测中α螺旋和不规则卷曲是主结构类型。RT-qPCR结果显示，BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达量最高，其次是腹部皮肤。

TNF 在机体内可由多种细胞产生，如单核巨噬细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、间充质细胞等，具有多种生物学效应，包括杀伤肿瘤细胞、调节免疫和炎症反应、促进淋巴细胞增殖等[6]。TNFRSF是通常含有TNF同源结构域的Ⅱ型跨膜蛋白的蛋白超家族。TNFRSF 的成员作为细胞因子发挥作用，通过与TNFRSF 受体结合，调节多种生物学过程，包括免疫反应、增殖、分化、凋亡和胚胎发生。在巨噬细胞、小胶质细胞谱系细胞中TNFRSF 的物质与细胞膜的BAFF/APRIL、LIGHT、GITRL、FasL、TWEAK 和CD137L（4-1BBL）结合[8]，启动反向信号传导来抑制细胞增殖。TNFRSF11b 蛋白是1997 年新发现的TNFRSF 的一个新成员，被称为破骨细胞形成抑制因子（OCIF 或OPG），是一种可以抑制骨的破坏和吸收的分泌型糖蛋白[10]。TNFRSF11b 能够与核转录因子（NF）-κB受体激活剂结合，抑制破骨细胞形成、分化、存活并诱导破骨细胞凋亡，是体内成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收动态平衡的重要调节因子，能促进骨代谢的稳态，参与骨密度的调节[7]。TNFRSF9 与TITegs 的激活有关，并且它们的抑制可能通过降低肿瘤中Tregs的免疫抑制功能来促进包括肺癌免疫治疗在内的抗癌治疗。TNFRSF9也能作为CD8+T细胞的共刺激受体，因此，TNFRSF9 的激动性抗体已经在临床试验中[11]。

现有研究表明，TNFRSF11b 蛋白是RANKRANKL-OPG[12]系统的核心一员，在骨质疏松症、类风湿性关节炎、骨癌等骨失调类疾病的发病机制方面起着中心作用。TNFRSF11b所具有的CRD1，2区段的单体小分子多肽可以灵活地与RANKL 竞争性结合[13]，阻止RANKL与RANK的结合，具体表现为成骨细胞及骨髓基质细胞表达的RANKL，与破骨细胞或破骨细胞前体细胞表面上的RANK 结合后，能够促进破骨细胞的分化，增强骨吸收活性[14]。成骨细胞系的多种细胞分泌表达OPG，与RANKL 竞争性结合，阻止RANKL 与RANK 的结合，从而阻止破骨细胞活化及抑制骨吸收[15]。TNFRSF9与TI-Tegs的激活有关，并且它们的抑制可能通过降低肿瘤中Tregs的免疫抑制功能来促进包括肺癌免疫治疗在内的抗癌治疗。TNFRSF9也能作为CD8+T细胞的共刺激受体。本研究成功克隆了BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因，并进行生物信息学分析，为蟾蜍抗肿瘤机制研究及进一步揭示TNFRSF11b 在RANK-RANKL-OPG 系统中的功能奠定基础，也为骨质疏松症患者带来福音[11]。同时，可以看到肌肉作为非药用部位表达量较高的组织，为开发蟾蜍新的药用部位提供了科学依据。

5 结论

从中华蟾蜍中克隆到BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9两个TNFSF家族的基因，BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA 序列为1233 bp，编码410 个氨基酸，BbgTNFRSF9基因的全长cDNA 序列为829 bp，编码247个氨基酸，进化树分析发现BbgTNFRSF11b和BbgTNFRSF9基因与其他动物同源性不高，组织表达分析显示，BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达显著高于其他部位，同时在肌肉中均有表达，为开发药用动物新资源提供数据支持。