家鸡MDH2基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体构建△

袁铭君，李军德，邢建永，高巍，闫士猛，张恬*

1.中国中医科学院 中药资源中心/道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室，北京 100700；

2.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；

3.华润三九（六安）中药材产业发展有限公司，安徽 六安 237300

苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）是一类广泛存在于动物、植物、微生物中的氧化还原酶[1]，主要参与三羧酸循环（TCA）、乙醛酸循环、苹果酸-天冬氨酸循环等代谢途径，是TCA的关键酶之一[2]，可催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换；此外，MDH 还参与了糖异生、氮同化、氨基酸合成、C4 循环[3]。目前MDH 已在多个领域有所应用，如亚种鉴定[4]、寄生虫疾病诊断[5]、抑制癌细胞[6]等。依据细胞内定位不同，MDH 产生了多种同工酶，常见的有胞质苹果酸脱氢酶1（MDH1）和线粒体苹果酸脱氢酶2（MDH2）[7]。李思光等[8]对泰和乌骨鸡肝、肾、眼、肌、脑和心6种组织中的MDH同工酶做了研究，发现不同组织中酶的分布各不相同，表现出明显的组织特异性；刘大林等[9]发现MDH基因可能是影响鸡屠宰性状和繁殖性状的主效基因；鸡肝脏MDH活性与其腹脂沉积、脂肪代谢有关[10]。本课题组前期对家鸡砂囊内壁蛋白质组分进行鉴定，发现砂囊内壁中含有MDH，丰度较高，且为MDH2，关于家鸡及其他禽类中MDH2的研究较少，其具有何种功能有待进一步探索。因此，本研究以家鸡砂囊内壁互补脱氧核糖核酸（cDNA）为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）克隆家鸡MDH2基因序列，并对其进行生物信息学分析；同时，利用实时荧光定量PCR 实验研究家鸡各组织/器官内MDH2基因相对表达量的差异；最后构建原核表达载体，以期为后续研究提供参考。

1 材料

1.1 样品

选取8 只健康家鸡，屠宰后迅速采集新鲜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、砂囊内壁组织，分装于5 mL冻存管中放入液氮中速冻，随后转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 试药

RNAprep pure 动物组织总核糖核酸（RNA）提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，批号：w0206]；Takara Primescript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit（批号：AL61653A）、PrimeSTAR®HS DNA Polymerase（批号：P10430）均购于宝日医生物技术（北京）有限公司；胶回收试剂盒（赛默飞世尔科技公司，批号：00965432）；pEASY-Blunt Cloning kit 型载体（批号：P41202）、2×M5 SuperFastTaq聚合酶（批号：22CB0801）、2×TranTaqHiFi PCR SuperMix（批号：Q10211）均购于北京全式金生物技术有限公司；DNA 限制性内切酶BamHI-HF（批号：10133331）、HindⅢ-HF（批号：10119609）均购于NEB公司；无缝克隆试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：H907KB1513]；pET 32a（+）（武汉淼灵生物科技有限公司）；考马斯亮蓝（批号：415E031）、氨苄青霉素（Amp，批号：20220429）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：20220315）均购于北京索莱宝科技有限公司；Plasmid Mini kit Ⅰ质粒DNA 小量提取试剂盒Ⅰ（Omega 公司，批号：D6943020000E19U095）；DH5α感受态细胞（批号：CP0050）、BL21（DE3）感受态细胞（批号：WR150）均购于华越洋生物科技有限公司。

1.3 仪器

SHA-C 型恒温水浴振荡器（常州润华电器有限公司）；Veriti™型PCR 仪、NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析仪（美国Thermo 公司）；QL-901 Vortex型漩涡震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；G:BOX F3 SYNGENE 型凝胶成像系统（Syngene 公司）；Centrifuge 5810R 型台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；HWS-28型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SCIENTZ08-Ⅱ型超声破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；CEBO-24 型高通量组织研磨仪（上海测博生物科技发展中心）；Microfuge 20R 型台式冷冻离心机（德国贝克曼库尔特公司）；BSC-IIA2 型生物安全柜（北京东联哈尔仪器有限公司）；JP-300 型电热恒温培养箱（武汉市武昌实验仪器厂）；DYY-6C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Bio-Rad 型电泳仪（美国安诺伦生物公司）；PowerLook 2100XLUSB 型蛋白凝胶成像系统[世群国际贸易（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 引物设计与合成

参照GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的家鸡MDH2的mRNA 序列（登录号：XM_040687148），使用Primer Premier 6.0 软件设计引物，引物详细信息见表1，引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表1 MDH2引物及内参引物序列信息

2.2 基因克隆

2.2.1 总RNA 提取与cDNA 合成 取新鲜组织50～100 mg，加入液氮中充分研磨。按照RNA 提取试剂盒说明书提取RNA。使用NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析仪和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量。按 照Takara Primescript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit 说明书，以RNA 为模板，反转录成cDNA，产物于-20 ℃冰箱中保存。

2.2.2 PCR 扩增 以cDNA 为模板，使用引物MDH2-F1 和MDH2-R1 进行PCR 扩增，PCR 反应体系（50 μL）：cDNA模板1 μL，上下游引物各2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，水30.5 μL。PCR 反应程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR 产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，按照胶回收试剂盒纯化获取目的片段，测序。

2.2.3 pEasy-MDH2 重组质粒的克隆与鉴定 将2.2.2项下所得回收目的片段与pEASY-Blunt克隆载体在25 ℃金属浴下连接15 min。连接体系（5 μL）：胶回收产物4 μL，pEASY-Blunt 克隆载体1 μL。取连接产物5 μL 转化至Trans-T1 感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热激30 s，加入450 μL 的LB 液体培养基（不含抗生素）37 ℃，200 r·min-1活化1 h。1500×g离心1 min，弃部分上清液，留200 μL 吹打混匀，涂布于LB 固体培养基（含Amp）上，37 ℃培养12 h 后挑取菌落，放入具有Amp 抗性的LB 液体培养基中震荡培养过夜。利用菌液PCR 方法鉴定分析pEasy-MDH2 阳性克隆，并测序鉴定，提取质粒DNA，-20 ℃冰箱保存。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 同源性分析 从美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载其他物种的MDH2 蛋白序列，使用MEGA-X 软件以Neighbor-Joining 法构建MDH2 蛋白的系统进化树。

2.3.2 理化性质分析 使用ExPASy ProtParam tool在线软件（https://web.expasy.org/protparam/）对家鸡MDH2 蛋白的多项理化性质进行分析，包括原子数、相对分子质量、等电点、不稳定指数、脂肪指数和亲水性平均值等。

2.3.3 亲/疏水性、磷酸化位点分析 使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在线软件对家鸡MDH2 蛋白的亲/疏水性进行计算和分析，采用NetPhos 3.1 Server 在线软件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测家鸡MDH2 蛋白的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的磷酸化位点。

2.3.4 信号肽、跨膜区结构预测和分析 使用SignalP 4.1 在线软件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1）预测信号肽，用TMHMM 在线软件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测蛋白跨膜区。

2.3.5 二级结构、结构域和三级结构预测和分析 用SOPMA 在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析家鸡MDH2蛋白的二级结构，InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）分 析MDH2 的结构域，在SWISS-MODEL 在线软件（https://swissmodel.expasy.org/interactive）中对家鸡MDH2蛋白进行建模。

2.4 家鸡MDH2基因在各组织中的表达分析

以家鸡6个组织cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR 检测MDH2基因的相对表达量。实时荧光定量PCR 扩增体系（总体积为10 μL）：TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 3 μL。实时荧光定量PCR 扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火34 s，共40 个循环；熔解曲线为94 ℃ 10 s，60 ℃45 s。重复3 次，以2-ΔΔCt法计算各组织中MDH2基因的相对表达量。最后利用GraphPad Prism 9.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2.5 构建原核表达载体

2.5.1 PCR 扩增及胶回收 以2.2.3 项下所提质粒DNA 稀释4 倍后作为模板，使用含酶切位点的引物30-MDH2-F1/R1进行PCR扩增，PCR反应体系（50 μL）：质粒DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TranTaqHiFi PCR SuperMix 25 μL，Nuclease-free water 22 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR 产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收纯化获取目的片段。

2.5.2 PET 32a（+）载体双酶切及回收纯化 取PET 32a（+）载体8.4 μL，依次加入10×NEBuffer 5 μL，Nuclease-free water 34.6 μL，BamHI-HF 和Hind Ⅲ-HF 各1 μL，37 ℃酶切3 h。按照OMEGA Cycle Pure kit 试剂盒说明书对酶切产物进行纯化，使用2.0%琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000 型微量核酸定量分析仪进行检测，纯化产物-20 ℃冰箱保存。

2.5.3 同源重组及转化 取2×Seamless cloning Master Mix 10 μL，2.4.2 项下所得线性化载体100.4 μL，2.4.1 项下所得胶回收产物0.56 μL，Sterilized ddH2O 补足至20 μL。50 ℃反应20 min，反应结束后立即置于冰上冷却2 min。取反应液4 μL至50 μL 的DH5a感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热激45 s 后冰上静置3 min。加入LB 液体培养基（不含抗生素）450 μL，于37 ℃，200 r·min-1活化1 h。1500×g离心1 min，弃部分上清，留200 μL吹打混匀，涂布于LB 固体培养基（含Amp）上，37 ℃培养12 h 后挑取菌落，放入具有Amp 抗性的LB液体培养基中震荡培养过夜。利用菌液PCR方法鉴定分析pET32a（+）-MDH2 阳性克隆，并测序鉴定，提取质粒DNA，-20 ℃冰箱保存。

2.5.4 MDH2 蛋白诱导表达 将测序正确的pET32a（+）-MDH2 阳性克隆转化至BL21（DE3），涂布于具有Amp 抗性的LB 固体培养基中培养过夜。挑取含有pET32a（+）-MDH2 重组质粒的BL21（DE3）阳性菌，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中震荡培养至600 nm处吸光度（A600nm）为0.6时，取部分菌液作为对照组，余下菌液加入1 mmol·L-1IPTG，在16 ℃、200 r·min-1摇床中诱导12 h。取出少量菌液，离心后去上清，沉淀用PBS 重悬后加人等体积的上样缓冲液，沸水中煮5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），之后用考马斯亮蓝染色初步鉴定MDH2蛋白是否表达。

3 结果与分析

3.1 家鸡MDH2基因克隆与测序

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量，可见28S 和18S 两条明显条带，且A260nm/A280nm为1.9～2.0，表明RNA 质量较好，可用于后续实验。以反转录得到的cDNA 为模板，进行PCR 扩增，获得1 条约1000 bp的特异性条带（图1）。切胶回收该片段，进行平端克隆与转化，最后进行菌落PCR 验证，选取阳性克隆测序，拼接测序结果，发现MDH2基因cDNA 序列长度为1120 bp，符合预期长度。通过NCBI ORF-Finder 工具，发现家鸡MDH2基因序列含1 个完整开放阅读框（ORF），其长度为1014 bp，编码337个氨基酸。

图1 MDH2基因电泳图

3.2 家鸡MDH2蛋白生物信息学分析结果

3.2.1 家鸡MDH2 蛋白同源性分析 提交12 个物种的MDH2 蛋白序列至MEGA-X 软件进行多序列比对，并根据比对结果构建相应的系统进化树，结果见图2。由图2 可知，家鸡与环颈雉进化距离最短，亲缘关系最近；与黑天鹅、绿头鸭、日本鹌鹑进化距离较小，亲缘关系较近，与大蟾蜍、斑马鱼、文昌鱼亲缘关系较远，而与猪、大家鼠、小家鼠、人的亲缘关系最远。

图2 MDH2蛋白的氨基酸序列同源性分析

3.2.2 家鸡MDH2 蛋白理化性质分析 通过Prot Param tool分析MDH2蛋白理化性质，结果显示蛋白分子式为C1592H2630N445O464S17，原子总数为5121，相对分子质量为35.95 kDa，等电点（pI）为9.17，偏碱性，为碱性蛋白。该基因编码的337 个氨基酸中涵盖了氨基酸的20 个种类，分别为丙氨酸（Ala，37 个，11.0%）、亮氨酸（Leu，30 个，8.9%）、甘氨酸（Gly，28 个，8.3%）、缬氨酸（Val，28 个，8.3%）、赖氨酸（Lys，24 个，7.1%）、异亮氨酸（Ile，22 个，6.5%）、苏氨酸（Thr，21 个，6.2%）、丝氨酸（Ser，20 个，5.9%）、脯氨酸（Pro，19 个，5.6%）、谷氨酸（GLU，19 个，5.6%）、精氨酸（Arg，16 个，4.7%）、天冬酰胺（Asn，14 个，4.2%）、苯丙氨酸（Phe，12 个，3.6%）、天冬氨酸（Asp，11 个，3.3%）、半胱氨酸（Cys，9 个，2.7%）、蛋氨酸（Met，8 个，2.4%）、组氨酸（His，7 个，2.1%）、谷氨酰胺（Gln，7 个，2.1%）、酪氨酸（Tyr，4个，1.2%）、色氨酸（Trp，1 个，0.3%），不稳定指数=34.19<40，属于稳定蛋白；脂肪指数为95.25，亲水性平均值=0.07>0，为疏水性蛋白。

3.2.3 家鸡MDH2 蛋白亲/疏水性、磷酸化位点分析结果 应用ProtScale 在线软件进一步分析MDH2蛋白的亲/疏水性，结果见图3。家鸡MDH2 亲水性最强的位点位于第282 位的Arg，得分为-2.711；疏水性最强的位点是位于第98 位的Ala，得分为2.167。家鸡MDH2蛋白的疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸，总体属于疏水蛋白。应用NetPhos 3.1 在线软件预测家鸡MDH2 蛋白的磷酸化位点，见图4，共有25个潜在磷酸化位点（阈值>0.5），其中Ser位点13 个、Thr位点12 个、Tyr位点0 个。但在该蛋白序列中，Thr-60、Ser-118、Ser-145、Ser-249、Ser-287 位点的得分接近阈值（0.5），表明这些位点被磷酸化修饰的置信度非常低，因此，家鸡MDH2 蛋白可能的磷酸化位点有25个。

图3 家鸡MDH2蛋白亲/疏水性分析预测结果

图4 家鸡MDH2磷酸化位点

3.2.4 家鸡MDH2 蛋白信号肽、跨膜区结构预测和分析结果 经SingnalP 5.0 预测发现，家鸡MDH2 蛋白无信号肽。通过TMHMM Server 2.0 在线软件分析发现MDH2 蛋白不含跨结构域，结果见图5。

图5 家鸡MDH2蛋白跨膜结构与预测

3.2.5 家鸡MDH2蛋白结构域、二级结构、三级结构预测和分析 使用InterProScan 软件分析，发现MDH2 蛋白属于MDH 家族，MDH2 蛋白序列的25～167 位氨基酸可形成辅酶Ⅰ（NAD）结合域，169～332 位可形 成α/βC 端结合域。通 过SOPMA 预测MDH2 蛋白二级结构，见图6，发现MDH2 蛋白由4种二级结构组成，分别为无规则卷曲（35.01%）、α-螺旋（40.95%）、β-转角（5.34%）、延伸链（18.69%），表明该蛋白质的氨基酸处在部分有序的二级结构中，利于其功能的正常发挥，最后利用SWISS-MODEL 对该蛋白质三级结构进行建模预测，其GMQE 得分为0.90，QMEAN 得分为0.90，结构中存在2 x MLT配体，见图7。

图6 SOPMA预测MDH2蛋白二级结构

图7 SWISS-MODE预测LMDH2蛋白三级结构

3.3 MDH2基因的组织表达分析

利用实时荧光定量PCR 检测家鸡6 个组织中MDH2的表达水平，结果表明MDH2在6 个组织中都有表达，但表达量存在显著性差异，脾脏、肺脏组织中几乎不表达，在心脏中显著高于其他组织（图8）。

图8 MDH2基因组织表达分析差异性（,n=8）

3.4 MDH2原核表达

SDS-PAGE 结果显示，诱导的pET-32a(+)-MDH2 重组质粒在53 kDa 处有一条特异蛋白条带（图9），与预期大小基本一致。上清和沉淀中均有MDH2 原核表达，但沉淀中表达较多，说明该重组蛋白主要是以包涵体的形式存在。

图9 重组MDH2蛋白SDS-PAGE电泳图

4 小结与讨论

本研究成功克隆了家鸡MDH2基因序列，全长1120 bp，ORF 1014 bp，共编码337个氨基酸。同源性分析发现，家鸡MDH2 与环颈雉亲缘关系最近，与黑天鹅、绿头鸭、日本鹌鹑亲缘关系较近，与大蟾蜍、斑马鱼、文昌鱼亲缘关系较远，而与猪、大家鼠、小家鼠、人的亲缘关系最远，说明不同物种间该基因相对不保守。家鸡MDH2 蛋白理化性质分析表明，家鸡MDH2 相对分子质量为35.95 kDa，pI 9.17，偏碱性，据报道苹果酸脱氢酶MDHs 相对分子质量为30～35 kDa[11]，最适pH 偏碱性（8.0 左右）[1]，家鸡MDH2 相对分子质量与理论等电点与文献报道范围接近。ProtParam tool 在线软件分析结果还显示，家鸡MDH2 蛋白为稳定蛋白，MDH2 蛋白结构的稳定性在一定程度上取决于分子内部的疏水作用，家鸡MDH2 蛋白疏水性氨基酸数量多于亲水性氨基酸，该蛋白整体表现为疏水性，所以该蛋白稳定性较好。同时，蛋白磷酸化会降低该蛋白的稳定性，MDH2 的蛋白磷酸化位点仅有25 个，故再次验证了该蛋白的稳定性。Signal1P-4.1在线工具分析结果表明该蛋白质无信号肽，说明其不是分泌蛋白，该蛋白质形成后会在细胞内发挥作用并降解。

MDH2 是三羧酸循环的关键酶之一，MDH2基因在家鸡心、肝、脾、肺、肾及鸡内金中均有表达，其中，其在心脏内的相对表达量最高。鸡心在鸡的生长代谢中起重要作用，由此推测MDH2与家鸡生长发育有关。MDH2基因在砂囊内壁及肾脏组织中的相对表达量次于心脏，MDH 广泛分布于植物、动物、微生物，因编码基因不同而产生了多种同工酶。许多同工酶在一个物种内表现出独特的空间和时间个体发生趋势，这种趋势在许多类群的各种同工酶中得到了证实，蜜蜂各发育阶段MDH2 酶活性存在差异[12]；不同发育阶段日本沼虾MDH 同工酶条带数目不一致，MDH2只在第2期出现[13]，目前市售鸡内金主要来源于家鸡，全国各地均有饲养。家鸡根据用途不同可分为肉用鸡、蛋用鸡、肉蛋兼用鸡，不同用途鸡种生长年限不同，不同生长年限的MDH2是否会发生变化有待进一步研究。

MDH还在一些动物的品种/亚系鉴定中有所应用。据报道，西方蜜蜂亚种MDH2基因座3 个等位基因频率不同[14]，Nunamaker 等[15]分析了10 个国家蜜蜂的血统，进一步验证MDH作为区分蜜蜂品种的可靠性，李举杯等[16]的研究证实了意大利蜂、卡尼鄂拉蜂、喀尔巴阡蜂的MDH2基因频率、基因型频率、杂合纯合度存在差异。关洪英等[17]发现鸡MD基因5′侧翼区具有多态性，俞亚波等[18]根据鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性建立了检测方法，能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型。家鸡品种丰富，包括地方品种（北京油鸡、清远麻鸡、仙居鸡等），培育品种（郑州红鸡、北京白鸡、海江黄鸡等），引入品种（白莱航鸡、白洛克鸡等）在内的上百个鸡种，造成了鸡内金来源复杂的现状。由此推测，使用MDH2 鉴别不同鸡种来源鸡内金具有一定可行性。另外，研究报道，硬骨鱼类MDH同工酶系统具有明显的组织特异性和物种特异性[19]；同时同源性分析显示，家鸡与绿头鸭MDH2 蛋白氨基酸序列亲缘关系较远，提示MDH同工酶系统鉴定鸡内金真伪也具有一定可行性。