烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别△

胡力，袁媛，张辉，张恬，金艳，赵玉洋，蒋超

1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；

2.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；

3.华润三九现代中药制药有限公司，广东 深圳 518029

水蛭是我国传统名贵中药，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定其为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman 或柳叶蚂蟥W.acranulataWhitman 的干燥全体，夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥。烫水蛭为取净水蛭段，按《中国药典》2020 年版炒法（通则0213），用滑石粉烫至微鼓起[1]。烫水蛭（蚂蟥）经过水提、浓缩、干燥、制粒成配方颗粒后，具有疗效稳定、规格统一、标准一致的优势。但由于加工后配方颗粒不再具备传统性状、显微等鉴别特征，运用传统方法对其进行鉴定具有很大的局限性。与传统鉴别方法相比，分子鉴定具有快速、准确、专属性强的特点，目前已建立多种分子鉴定方法用于中药材、中药饮片[2-8]、中成药的基原鉴定[9-12]。

DNA 作为遗传信息的载体，具有信息量大、遗传稳定性高、化学稳定性强等特点[13]，对于煎煮炮制后的中药物种鉴定具有天然的优势。位点特异性聚合酶链式反应（PCR）是基于单核苷酸多态性（SNP）位点的一种基因分型方法，使用具有种属特异性的引物进行PCR 扩增，仅目的物种可检测到扩增产物，并通过琼脂糖凝胶电泳法检测PCR 产物是否存在，可进行定性判断。特异性PCR 鉴定已广泛应用于贵细药材、冷背药材、外来药材及其提取液和配方颗粒的基原鉴定中[14-18]，尤其对配方颗粒进行专属性鉴别，有助于保证临床用药的安全性、有效性。本研究拟建立烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒PCR 鉴别方法，为规范烫水蛭（蚂蟥）及其相关产品质量提供检测依据。

1 材料

1.1 仪器

Veriti™ 型PCR 仪、GeneAmp 9700 型PCR 仪、Veriti™ PRO 型PCR 仪（Applied Biosystems 公司）；TC-512 型PCR 仪（Techne 公司）；SYNGENE 型凝胶成像系统（Gene公司）。

1.2 试剂

Wizard®SV Genomic DNA Purification System（美国Promega 生物公司，批号：0000518550）；2×M5 PCR Mix（北京聚合美生物科技公司，批号：23DB0801）；2×TaqPCR Mix（金百特生物公司，批号：P0195）；SpeedSTAR HSTaqDNA 聚合酶、LATaqHS DNA 聚合酶、6×loading buffer（日本Takara公司，批号分别为AK81590A、AL22021A、R10201）；Trans2000 DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号：R20222）；GelRed 核酸染料（北京兰博利德公司，批号：R0010407）。

1.3 样品

烫水蛭（蚂蟥）、标准汤剂冻干粉、配方颗粒由华润三九医药股份有限公司提供。烫水蛭（蚂蟥）饮片（批号为2005001～2005015）经中国中医科学院蒋超副研究员鉴定为烫水蛭（蚂蟥）Whitmania pigraWhitman（表1）。以鉴定后烫水蛭（蚂蟥）饮片制备了15 批烫水蛭（蚂蟥）标准汤剂冻干粉（批号为2005001Y～2005015Y），为了建立统一准确的鉴定标准，对生产过程中的各个阶段都进行了样品收集和制备，烫水蛭和水蛭相比经过了炮制加工，为考察分子标记对不同加工阶段样品的鉴定效果，制备了3 批配方颗粒中间体（批号为520901Y～520903Y），3 批配方颗粒成品（批号为2010001Y～2010003Y）。为了确保使用的分子鉴定标记对不同加工阶段样品都有良好的鉴定效果，收集了3 批水蛭（蚂蟥）饮片，取出一部分饮片制成烫水蛭（蚂蟥）饮片，再将两者制成相应的3 批标准汤剂冻干粉用于生熟异治区分（表2）。收集7 批阴性样品（包括《中国药典》2020 年版中规定的烫水蛭的另外2 个来源）：1 批柳叶蚂蟥W.acranulataWhitman、2 批水蛭Hirudo nipponicaWhitman、2 批海南山蛭Haemadipsa hainanaSong、2 批菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson（表3）作为常见混伪品。混伪品由中国中医科学院蒋超副研究员鉴定。烫水蛭（蚂蟥）对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121061-201305）。

表1 15批烫水蛭（蚂蟥）饮片信息

表2 烫水蛭（蚂蟥）生熟异治样品

表3 烫水蛭（蚂蟥）阴性样品

2 方法

2.1 DNA提取

使 用Wizard ® SV Genomic DNA Purification System 试剂盒依据说明书步骤提取。样品模板DNA溶液提取完成后置4 ℃冰箱保存备用。

2.2 引物设计

通过对比烫水蛭（蚂蟥）与同属近源种及常见伪品的细胞色素C 氧化酶Ⅰ（COⅠ）序列选择特异性片段设计烫水蛭（蚂蟥）特异性PCR 鉴别引物，筛选出烫水蛭（蚂蟥）的稳定引物区间；在区间内筛选获得烫水蛭（蚂蟥）的特异性SNP 位点，将烫水蛭（蚂蟥）序列中的5ʹ-TTTCCTCGTCTGAATAAC-3ʹ特异性位点C 的前一位从A 替换为T，设计烫水蛭特异性鉴别引物TSZ-F 及TSZ-R，其中上游引物序列TSZ-F为5ʹ-TTTCCTCGTCTGAATATC-3ʹ，下游引物序 列TSZ-R 为5ʹ-GAGATACGGAGTCTG ATAG-3ʹ。预期PCR 产物长度为133 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 PCR扩增条件

取烫水蛭（蚂蟥）饮片、烫水蛭（蚂蟥）标准汤剂冻干粉、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒及混伪品DNA考察退火温度（54、56、58、60 ℃）、PCR 循环数（32、34、36、38 个循环）、Taq酶种类（2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaq和LATaqHS）、DNA模板量（75.0、37.5、15.0、6.0 ng）对PCR 鉴别结果稳定性的影响。筛选出最适合的鉴别条件，对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒进行位点特异性PCR鉴别。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3 PCR鉴别条件的确定与耐用性考察

3.1 退火温度

使用烫水蛭（蚂蟥）特异性鉴别引物进行PCR扩增，选用Veriti™ PRO 型PCR 仪进行扩增，扩增体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34 次（94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min，其中退火温度分别设置为54、56、58、60 ℃。结果表明，在54 ℃时，烫水蛭（蚂蟥）饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒能在100～250 bp（约133 bp）处扩增得单一明亮条带，混伪品和阴性样品在56～58 ℃时出现弱扩增，随着退火温度升高，扩增效率降低导致配方颗粒的条带逐渐变暗甚至消失；60 ℃时配方颗粒条带模糊不清，无法作为鉴别依据（图1）。为避免产生假阳性或假阴性结果，选择PCR退火温度为54 ℃。

图1 退火温度对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

3.2 循环次数考察

分别选用32、34、36、38个循环进行考察，选用Veriti™ PRO 型PCR 仪进行扩增，扩增体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 参数：95 ℃预变性5 min，循环反应（94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。结果表明，在32～38个循环时烫水蛭（蚂蟥）饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒在100～250 bp（约133 bp）处扩增得单一明亮条带，均能得到正确鉴别结果，36～38 个循环时混伪品和阴性样品出现扩增条带（图2）。为保证结果的稳定性和准确性，选择34个循环进行PCR。

图2 循环次数对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

3.3 不同Taq酶考察

为测试不同种类的Taq酶对烫水蛭（蚂蟥）及其混伪品鉴别结果的影响，分别使用2×M5 PCR Mix、2×TaqPCR Mix、SpeedSTAR HSTaqDNA、LATaqHS DNA 聚合酶进行测试。选用Veriti™ PRO型PCR仪进行扩增，扩增体系为Taq酶12.5 μL、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34 次（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。结果表明，除2×M5 PCR Mix 在100～250 bp（约133 bp）扩增出单一明亮条带外，使用其他Taq酶均未在100～250 bp 扩增出目的条带，因此选择2×M5 PCR Mix作为最优的Taq酶（图3）。

图3 不同Taq DNA聚合酶对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

3.4 DNA模板量考察

对25 μLPCR 体系中的模板DNA 用量进行了考察，调整DNA 质量浓度约15 ng·μL-1，选用Veriti™PRO 型PCR 仪进行扩增，扩增体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，分别设置5.0、2.5、1.0、0.5 μL 的DNA 模板（DNA 量分别相当于75.0、37.5、15.0、6.0 ng），ddH2O 的量分别为6.7、9.2、10.7、11.2 μL。PCR 参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34 次（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。结果表明，DNA 模板量为0.5～5.0 μL均能在100～250 bp（约133 bp）扩增出单一明亮条带（图4）。为防止模板质量浓度过高产生假阳性或过低产生假阴性结果，选择DNA 模板量为25 μL（约37.5 ng）。

图4 DNA模板量对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

3.5 不同PCR仪考察

为测试不同PCR 仪对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒及其混伪品鉴别结果的影响，分别使用4 种PCR 仪进行扩增。扩增体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模 板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR 参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34 次（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。结果表明，使用Veriti™ 型、GeneAmp 9700 型、Veriti™ PRO 型PCR仪均可获得正确的鉴定结果，而使用TC-512 型PCR仪未成功扩增出条带（图5），表明进行烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒PCR 鉴别时应对扩增温度进行微调，并进行方法确认。

图5 不同PCR仪对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

3.6 引物用量考察

为测试不同引物用量对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒及其混伪品鉴别结果的影响，分别使用4个引物用量进行扩增，引物浓度为10 μmol·L-1。选用Veriti™ PRO型PCR仪扩增，扩增体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，分别设置0.2、0.4、0.6、0.8 μL（10 μmol·L-1）的烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物，DNA 模板2.5 μL，ddH2O 的量分别为9.6、9.2、8.8、8.4 μL。PCR 参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34 次（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。结果表明，引物用量为0.2～0.8 μL 时正品均可获得正确的鉴定结果，而引物用量>0.6 μL 时伪品出现杂带（图6）。为了防止引物浓度过高导致杂带产生，选择烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒PCR鉴别时引物浓度为10 μmol·L-1，用量为0.4 μL。

图6 引物用量对烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别结果的影响

根据以上结果，确定烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒PCR 鉴别的条件为PCR 体系为25 μL，包括2×M5 PCR Mix 12.5 μL、烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、DNA 模板2.5 μL、ddH2O 9.2 μL。PCR参数：95 ℃预变性5 min，循环反应34次（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。4～10 ℃保存。

3.7 专属性考察

使用所建立的烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒PCR 鉴定方法对烫水蛭（蚂蟥）饮片、配方颗粒、标准汤剂冻干粉及其混伪品进行鉴定。结果表明，烫水蛭饮片，标准汤剂冻干粉和配方颗粒成品均能在100～250 bp（约133 bp）扩增出单一明亮条带，7 批混伪品均无条带（图7）。

图7 烫水蛭（蚂蟥）专属性考察

3.8 适用性考察

使用所建立的烫水蛭配方颗粒PCR 鉴定方法对15 批水蛭（蚂蟥）饮片进行适用性考察（图8）。结果表明，15 批水蛭（蚂蟥）饮片均能得到正确的鉴定结果。对15 批烫水蛭（蚂蟥）饮片、15 批烫水蛭（蚂蟥）饮片标准汤剂冻干粉、3 批烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒中间体、3 批烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒、3 批水蛭（蚂蟥）饮片、3 批烫水蛭（蚂蟥）饮片、3 批水蛭（蚂蟥）饮片标准汤剂冻干粉、3 批烫水蛭（蚂蟥）饮片标准汤剂冻干粉进行适用性考察，凝胶电泳图谱结果与烫水蛭对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250 bp存在单一DNA 条带，空白对照无条带（图9）。

图8 15批水蛭（蚂蟥）饮片适用性考察

图9 烫水蛭配方颗粒适用性考察

4 结语

药源调查和全面的样品采集是建立准确、可靠PCR鉴别方法的前提。烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒经过了高温水煮、干燥、制粒等一系列制备工艺，DNA高度降解，且加工后丧失性状与显微鉴别特征，传统的鉴定手段无法满足烫水蛭配方颗粒鉴定的需求。

配方颗粒经过加工后，DNA 降解程度较大，留存的DNA片段较小，在进行特异性PCR鉴别时，主要依据存在变异的短小片段进行特异性PCR 鉴别。相较于原药材，在进行配方颗粒PCR 扩增时，退火温度不能过高，过高的退火温度会导致扩增效率降低，加之配方颗粒的DNA 质量浓度较低会导致配方颗粒扩增条带逐渐变暗甚至消失。此外，配方颗粒也需要较高的PCR 循环来保证目的条带的产生。上述因素使得对配方颗粒PCR 鉴别的引物特异性要求较高，在筛选引物时，应选择扩增效果好、条带明亮清晰、阴性样品无目的条带的引物。

使用本研究建立的特异性PCR 方法对多批水蛭（蚂蟥）饮片、烫水蛭（蚂蟥）饮片、烫水蛭（蚂蟥）标准汤剂冻干粉及烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒等进行检验。结果表明，63 批样品均在100～250 bp 见单一特异性鉴别条带。专属性考察结果表明，烫水蛭（蚂蟥）正品饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒均在100～250 bp 见单一特异性鉴别条带，水蛭另外2 个来源及伪品均无条带。以上结果表明，本研究建立的烫水蛭（蚂蟥）特异性鉴别方法对配方颗粒具有良好的适用性及专属性，可为烫水蛭（蚂蟥）药材及其配方颗粒等加工产品提供相应的检测工具，为完善烫水蛭（蚂蟥）的质量控制体系、保障其临床应用提供依据，也为其他中药品种的配方颗粒鉴别方法研究提供参考。