p62敲除对细胞自噬的影响及其对泛素化修饰蛋白募集的作用

刘世玉, 冯学召, 古丽妮尕尔·司马义, 席 庆, 阿仙姑·哈斯木, 米 娜

(新疆医科大学1生物化学教研室, 2病理生理学教研室, 3生物学教研室, 乌鲁木齐 830017;4新疆医科大学第七附属医院, 乌鲁木齐 830092;5新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院, 乌鲁木齐 830054)

自噬是一种在维持细胞稳态中起多种作用的溶酶体降解途径,分为选择性自噬和非选择性自噬[1]。饥饿、细胞器损伤等反应都会增加细胞自噬[2]。在选择性自噬中,p62/Sequestosome-1作为一种支架蛋白,用来降解泛素化基质的载体[3],并通过自身的互作作用和泛素结合结构域(Ubiquitin binding domain,UBA)结合,进一步促进泛素化聚集体的形成和降解。泛素-蛋白酶体(Ubiquitin-proteasome system,UPS)和自噬是细胞中最主要的蛋白质降解系统,相关研究证实了两者间存在密切联系,泛素作为这两类系统共同的底物识别信号,在其中起到连接的作用[4]。微管相关蛋白1轻链3(LC3)被自噬相关蛋白酶ATG4裂解形成胞质LC3Ⅰ,被进一步识别后,LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine,PE)结合形成LC3Ⅱ,即LC3酯化[5]。与外膜结合的LC3Ⅱ被ATG4裂解,被重新用于新一轮的酯化[6]。前期研究证实了这些蛋白分子在自噬中的核心作用,p62和多聚泛素化蛋白是p62体的支架,而作为自噬的成核位点的p62体被隔离在自噬体中[7]。本实验通过观察和对比野生型(Wild Type,WT)和p62基因敲除(p62 knockout,p62-KO)的大鼠肾上皮细胞(NRK)经饥饿处理后的自噬体形成、LC3蛋白阳性囊泡点状结构的数量变化、LC3酯化和泛素化修饰蛋白(Ub)的表达水平,证实p62敲除不影响非选择性自噬,并初步探究p62与泛素化修饰蛋白结合对自噬降解途径的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂C2plus激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司);Heracell 150iCO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);KS18生物安全柜(美国Thermo Scientific公司);垂直电泳仪、电泳槽及相关配套设备、湿转膜仪(美国Bio-Rad公司)、高速低温离心机(美国Sigama公司);DMEM培养基(美国Gibco公司);DPBS培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(以色列BI公司,04-002-1A);谷氨酰胺(美国Thermo Fisher Scientific公司,25030081);磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Hyclone公司);青霉素-链霉素(美国Hyclone公司,SV30010.01);大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)、p62基因敲除的细胞由清华大学生命科学系俞立教授实验室赠送;LC3(# PM036,1∶1 000)、p62(# PM045,1∶1 000)均购自美国MBL公司;GAPDH(美国Affinityaffbiotech公司,AF7021);Goat Anti-Rabbit Ig(美国SouthernBiotech公司,4010-05);Ubiquitin(中国CST公司,# 3936S,1∶5 000)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组 用含有10%胎牛血清和1% (青霉素-链霉素)的DMEM培养基培养细胞,置于37℃、5%细胞培养箱中,培养至全皿的90%时,对细胞进行传代、铺板及收样。将野生型(Wild Type,WT)和p62基因敲除(p62 knockout,p62-KO)的NRK细胞分别分为野生型阴性对照组(WT CT组)和野生型饥饿4 h组(WT Sta4 h组)、p62基因敲除阴性对照组(p62-KO CT组)和p62基因敲除饥饿4 h组(p62-KO Sta4 h组)。WT CT组和p62-KO CT组中加入普通培养基,对细胞进行空白对照处理;WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中加入饥饿培养基,对细胞进行饥饿4 h处理。

1.2.2 鉴定p62敲除的细胞 免疫印迹法检测野生型(WT)细胞与p62基因敲除(p62-KO)细胞中p62的表达水平。

1.2.3 电子显微镜观察细胞自噬情况 在培养皿中培养野生型(WT)细胞和p62基因敲除(p62-KO)细胞,用1∶1的2.5%戊二醛和DMEM在室温下固定5 min;弃去培养基,2.5%戊二醛、4℃中孵育45 min;用0.1 M碳酸钠缓冲液(pH 7.3)冲洗2次,20 mM甘氨酸处理5 min,洗涤5 min后,1 mg/mL DAB室温孵育2 min,加入过氧化氢至0.03%,继续孵育15 min,用电子显微镜(TEM)观察WT细胞和p62-KO细胞中的自噬体数量。实验重复3次。

1.2.4 免疫荧光法检测LC3蛋白阳性点状结构的数量 将细胞置于盖玻片上生长,弃去培养基,PBS清洗1次,室温下用4%的多聚甲醛固定10 min,PBS清洗3次;含有0.1%皂素的山羊血清中封闭10 min,使细胞穿孔;在山羊血清中孵育30 min,用荧光一抗对细胞进行染色1 h,PBS清洗3次;细胞被染色后用荧光二抗室温避光孵育1 h,PBS清洗3次;用激光共聚焦显微镜观察WT细胞和p62-KO细胞中LC3蛋白阳性囊泡点状结构的数量(以每次实验大于50个细胞并在5个视野以上进行统计)。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测LC3的酯化水平及泛素化修饰蛋白的表达水平 取对数生长期的WT和p62-KO细胞,以3×105个/mL接种至六孔板中,培养14 h后,PBS清洗3次,DPBS饥饿处理4 h。免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测细胞中泛素化修饰蛋白(Ub)和自噬体标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白在细胞中的表达水平。同上将待处理的细胞进行饥饿处理4 h后,弃去培养基,PBS冲洗1次,加入适量细胞裂解液,100℃变性15 min,在8%～12%的SDS-PAGE上电泳,湿转法至醋酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,免疫结合抗体室温孵育1 h,化学发光法(ECL)进行X胶片的显影。采用Fiji-Image进行灰度值的统计。

2 结果

2.1 p62基因敲除细胞的鉴定免疫印迹法鉴定野生型(WT)细胞与p62基因敲除(p62-KO)细胞中p62基因的敲除情况,结果显示,与WT细胞比较,p62-KO细胞中未见p62蛋白表达,提示p62-KO细胞中的p62基因被成功敲除(图1)。

图1 p62基因敲除细胞的鉴定

2.2 WT和p62-KO细胞的自噬情况结果显示,饥饿处理4 h后,WT和p62-KO细胞中均能观察到自噬结构(包括自噬体和自噬溶酶体),且自噬体的数量在p62-KO细胞中未见明显减少(图2)。

A: WT B: p62-KO

2.3 饥饿诱导下的自噬细胞中LC3蛋白阳性点状结构数量的比较野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK细胞饥饿处理4 h后,与WT CT组比较,WT Sta4 h组中LC3蛋白阳性点状结构数量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与p62-KO CT组比较,p62-KO Sta4 h组中LC3蛋白阳性点状结构数量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。饥饿处理4 h后,WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中LC3蛋白阳性点状结构数量比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1、图3)。

表1 饥饿诱导下的自噬细胞中LC3蛋白阳性点状结构数量的比较

注: A, 图中绿色点代表LC3蛋白阳性点状结构的数量(比例尺:10 μm); B, 饥饿处理后WT和p62-KO细胞中LC3蛋白阳性点状结构的数量。

2.4 p62敲除对细胞中自噬关键蛋白LC3酯化的影响野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK细胞饥饿处理4 h后,与WT CT组比较,WT Sta4 h组中LC3蛋白酯化水平升高,差异有统计学意义 (P<0.01);与p62-KO CT组比较,p62-KO Sta4 h组中LC3蛋白酯化水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。饥饿处理4 h后,WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中LC3蛋白酯化水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(表2、图4)。

表2 p62敲除对细胞中自噬关键蛋白LC3酯化的影响

注: A, 免疫印迹法检测自噬关键蛋白LC3蛋白的酯化水平; B, 饥饿处理后WT和p62-KO细胞中LC3蛋白的酯化水平。

2.5 p62与泛素化修饰蛋白结合对细胞自噬的影响野生型(WT)和p62基因敲除(p62-KO)的NRK细胞饥饿处理4 h后,与WT CT组比较,WT Sta4 h组中Ub蛋白和LC3蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义 (P<0.01);与p62-KO CT组比较,p62-KO Sta4 h组中Ub蛋白和LC3蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01～0.05)。饥饿处理4 h后,WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中Ub蛋白和LC3蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3、图5)。

表3 p62与泛素化修饰蛋白结合对细胞自噬的影响

3 讨论

自噬主要负责清除错误折叠的蛋白质以及受损的细胞器,在维持细胞稳态中起重要作用。研究表明,p62通过溶酶体介导自噬来维持细胞内环境稳态,参与细胞信号传导和蛋白质的聚集及降解[8]。p62能够将泛素化蛋白,如tau,递送到蛋白酶体中进行降解[9]。泛素-蛋白酶体系统(UPS)在短寿命、错误折叠和受损的蛋白质降解中起到了重要作用[10],但p62对泛素化修饰蛋白在自噬体形成中的的相关机制仍需进一步探讨。

本研究发现,在饥饿处理后的p62-KO细胞中,自噬体数量未见明显减少,而LC3蛋白阳性点状结构的数量显著增多,提示在饥饿后的p62-KO细胞中,自噬强度增加,自噬流正常,说明p62敲除并不影响自噬的发生。p62作为一种自噬底物受体,在选择性自噬中与泛素化底物蛋白相结合[11]。研究表明,自噬与泛素化蛋白酶体系统间存在相关性,抑制蛋白酶体的表达能够诱导自噬,诱导后的自噬能够降解泛素化及错误折叠的蛋白,而抑制自噬会引起短期蛋白质的聚集,干扰一个系统的功能会影响另一个系统的表达[12]。本研究通过调控p62的分子水平,发现在p62-KO细胞中泛素化修饰蛋白是积累的,这表明p62在选择性自噬中的作用不可或缺。p62通过特定的结构域,如UBA和LC3结合区域,与泛素化修饰蛋白相互作用,说明p62能够将泛素化修饰蛋白引至自噬体,从而促进自噬的降解。这一研究揭示了p62作为一个自噬适配体蛋白的重要功能。p62的过度表达与多种疾病的发展相关[13]。研究发现p62的泛素化修饰和翻译后修饰可以影响其与泛素化修饰蛋白的相互作用及募集能力[14],这表明p62的调控机制是多样且复杂的,可能涉及多个信号通路和修饰方式的调控。本研究结果显示,与WT CT组和p62-KO CT组比较,WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中Ub蛋白表达水平显著升高,且在p62敲除细胞中有更多的积累,特别是LC3酯化水平的升高,强调了p62与Ub修饰的蛋白结合后使自噬作用增强。

本研究证实了p62在选择性自噬中的重要作用,作为底物接头蛋白,p62能够募集泛素化修饰蛋白并促进其降解,这有助于深入了解细胞自噬的调控机制。通过比较WT和p62-KO细胞中自噬体的形态和数量,发现p62的敲除并不影响自噬体的形成,但影响了选择性自噬体底物的凝聚和降解。这表明自噬过程中不同组分的功能可以分开调节,从而揭示了选择性自噬的调控机制的复杂性。

综上,本研究中p62敲除后泛素化蛋白的积累,尤其是饥饿处理后泛素修饰蛋白的积累加剧,进一步说明p62在自噬的泛素化系统中发挥重要功能。因此,本研究对于深入理解自噬与疾病之间的关系,并为相关疾病的治疗提供新的治疗靶点和策略具有重要意义。