N-乙酰半胱氨酸联合万古霉素对耐甲氧金黄色葡萄球菌及其生物膜的清除作用研究

郑靖杰, 阿不都赛米·艾买提,3, 薛德文, 曹 力,2,3

(1新疆医科大学第一附属医院关节外科, 2新疆地区高发疾病研究教育部重点实验室, 3新疆骨科疾病临床医学研究中心, 乌鲁木齐 830011)

在临床疾病的治疗中,各种感染始终是困扰无数外科医生的难题[1]。超过65%的感染均与生物膜的产生有关[2]。细菌生物膜(Biofilm,BF)是细菌黏附于生物材料或组织表面后,通过分泌胞外多糖,纤维蛋白等物质,进一步聚集黏附,最终构成一个由多糖蛋白复合物、细菌、核酸等物质共同组成的,紧密黏附于载体表面的膜状物[3]。耐甲氧金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)作为金黄色葡萄球菌的亚种,有着很强的生物膜形成能力[4]。因其对万古霉素表现敏感,使得万古霉素成为对抗MRSA菌感染的首选抗生素[5],但生物膜的存在大大提高了MRSA菌对抗抗生素的能力[6]。生物膜可在多种骨科材料表面附着[7]。细菌在假体及周围组织的定植形成的生物膜,导致假体周围感染迁延不愈,反复发作[8]。因此生物膜的有效清除手段成为关节外科研究的重点。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是半胱氨酸(L-Cysteine,Cys)的N-乙酰化的衍生产物,其具有很强的溶解黏液作用。NAC通过使大分子糖蛋白多肽链中的二硫键(-S-S-)断裂,使黏液液化[9]。NAC对生物膜的清除作用虽然目前国内外学者做了一些相关研究[10],但联合抗菌素使用实验较少。本实验采用金黄色葡萄球菌中易形成生物膜,临床较难处理的MRSA菌种作为研究对象[11],研究NAC联合万古霉素对MRSA菌及其生物膜的清除效果。本研究首次通过激光共聚焦及多时间段生物膜内细菌定量分析证实乙酰半胱氨酸联合万古霉素对MRSA细菌生物膜结构及生物膜内细菌的影响,为联合用药清除细菌生物膜提供了思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器主要试剂及材料:MRSA(BAA-1556,美国ATCC),万古霉素(VIANEX,希腊),N-乙酰半胱氨酸(C8460,Solarbio),电镜固定液(赛维尔,中国武汉),LB 肉汤(索莱宝,中国北京),琼脂粉(Biofroxx 公司,德国),LIVE/DEAD细菌活力检测试剂盒(L7012,ThermoFisher Scientific公司,美国),1%结晶紫染色液(G1062,Solarbio),PBS粉末(Gibico公司,美国),共聚焦用玻璃培养皿(YA0570,Solarbio),麦氏比浊管(YA0180,Solarbio)。主要仪器:酶标仪(ThermoFisher Scientific公司,美国),扫描电子显微镜JSM-7610FPlus(电子株式会社,日本),激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司),临界点干燥仪(K850)(Quorum 公司,英国),离子溅射仪(MC1000)(HITACHI 公司,日本),加热型超声波清洗仪(沃信仪器制造,中国无锡),恒温培养箱(精宏,中国上海)。实验完成于新疆地区高发疾病研究教育部重点实验室(新疆医科大学),新疆骨科疾病临床医学研究中心。

1.2 实验方法

1.2.1 MRSA细菌生物膜体外培养 使用10 μL接种环挑取MRSA菌并接种于25 mL LB肉汤液体培养基中。液体培养基置于细菌摇床,37℃摇菌12 h。利用麦氏比浊管测算细菌浓度,并应用LB肉汤稀释菌液至106CFU/mL浓度。选取6孔板,每孔放入22 mm×22 mm无菌盖玻片,加入4 mL,浓度为106CFU/mL的菌液。将6孔板放入37℃细菌培养箱中,静置培养1、6、12、24、48、72 h,培养完成后取出盖玻片,置入无菌PBS溶液中清洗3次,洗去未附着的细菌。使用0.1%结晶紫溶液染色20 min。染色完成后以PBS清洗3次,去除未结合的染料。通过光学显微镜观察生物膜形成状态。

1.2.2 实验分组 本研究分5组,分别为空白对照组、万古霉素组、乙酰半胱氨酸组、万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组、万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组。空白对照组不予以任何药物,细菌自然生长形成的生物膜作为对照。万古霉素组予以5 mg/mL浓度万古霉素进行干预。乙酰半胱氨酸组予以20 mg/mL药物进行干预。万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组予以5 mg/mL浓度的万古霉素以及5 mg/mL浓度的乙酰半胱氨酸进行干预。万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组予以5 mg/mL浓度的万古霉素以及20 mg/mL浓度的乙酰半胱氨酸进行干预。

1.2.3 生物膜面积半定量测定 通过结晶紫染色法对生物膜面积进行半定量测定与分析。对96孔板进行标记并分组。分组的各孔均加入100 μL浓度为106CFU/mL的菌液。将96孔板置入37℃恒温箱培养48 h,使生物膜附着于各孔孔壁及底部。单通道移液器移去孔内培养基,按照分组于各组加入药物。加样完成后置入37℃恒温箱培养24 h。弃去各组培养基。重新加入无菌PBS清洗3次,洗去未黏附的细菌。自然晾干后各孔加入0.1%结晶紫溶液100 μL,染色20 min。然后以PBS洗去多余的结晶紫。加入无水乙醇溶解生物膜内的结晶紫5 min,将溶解后的液体移至新的96孔板并做对应标记分组。通过酶标仪测定590 nm处的光密度(Optical density,OD)值。

1.2.4 生物膜内细菌定量分析 建立生物膜方法同前。备新的6孔板,将带有生物膜的盖玻片放于各孔内,按照分组于各组加入药物。每24 h更换对应药物浓度的培养基。培养24、48及72 h后将盖玻片取出。用50 mL无菌PBS清洗3次,去除残余药物。将清洗后的玻片置于50 mL无菌离心管内,加入40 mL无菌PBS,37℃超声震荡20 min以释放生物膜内残存细菌。取100 μL上述超声震荡后的液体,稀释10倍、100倍、1 000倍后,以L型涂布棒均匀涂布于LB琼脂培养板,各涂3板。放置于37℃培养箱中培养24 h。统计各平板菌落数。此实验重复3次。计算公式:每毫升震荡液中细菌浓度=(菌落数×10×稀释倍数)CFU/mL。

1.2.5 生物膜结构分析 通过荧光染色及激光共聚焦观测,对生物膜结构进行分析。各组准备共聚焦玻璃培养皿3个,培养皿中加入1 mL,浓度为106CFU/mL的菌液,培养48 h,使生物膜附着于皿上。弃去培养皿中原有培养基,按照分组加入各组药物。在37℃恒温箱内培养24 h后弃去培养基,重新加入无菌PBS缓冲液清洗3次。按照LIVE/DEAD BacLight细菌活力检测试剂盒说明书。每1 mL 生理盐水加入5 μL SYTO9和5 μL PI配置染色液。每个培养皿加入1 mL染色液进行染色,遮光染色15 min。染色完成后弃去染色液,加入生理盐水清洗3次,洗去多余染料。加入1 mL生理盐水,避光转移至共聚焦显微镜下观察。于480 nm波长下观测SYTO9染色,于530 nm波长下观测PI染色并进行拍照。利用NIS Viewer Ver420对图像进行处理。

1.2.6 生物膜形态观察 通过扫描电子显微镜对生物膜的形态进行观察。选取6孔板,每孔放入22 mm×22 mm无菌盖玻片,加入4 mL,浓度为106CFU/mL的菌液,培养48 h,使生物膜附着于玻片上。备新的6孔板,将带有生物膜的盖玻片放于各孔内,按照分组加入各组药物。在37℃恒温箱内培养24 h后弃去培养基,重新加入无菌PBS缓冲液清洗3次。加入2 mL电镜固定液4℃冰箱固定过夜,依次用50%、75%、80%、95%、无水乙醇的梯度乙醇中脱水,每个15 min。用临界点干燥仪干燥,离子溅射仪进行真空喷镀金粉。于扫描电镜下观察,放大倍数10 000倍。

2 结果

2.1 MRSA细菌生物膜体外培养以及最大密度生成时间测算对生物膜进行结晶紫染色后于400倍光学显微镜下观察,可见1～48 h过程中生物膜黏附逐步增加,于48 h达到最大面积。72 h生物膜密度更大,但早期黏附呈片状分布的生物膜部分分散。因此本实验过程中生物膜体外形成时间均为48 h,如图1所示。

2.2 N-乙酰半胱氨酸联合万古霉素对MRSA细菌生物膜清除效果的测试MRSA菌在各分组载体表面形成生物膜的半定量结果(波长=590 nm)分别为空白对照组1.32±0.60,万古霉素组1.05±0.15,乙酰半胱氨酸组0.53±0.20,万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组0.35±0.11,万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组0.29±0.10。与空白对照组比较,万古霉素组、乙酰半胱氨酸组、万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组、万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组生物膜面积均减少,差异有统计学意义(P<0.05);与万古霉素组比较,乙酰半胱氨酸组、万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组、万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组生物膜面积均减少,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

注: 与空白对照组比较, #P<0.05; 与万古霉素组比较, *P<0.05。

2.3 N-乙酰半胱氨酸联合万古霉素对MRSA菌生物膜内细菌清除效果测定分别对24、48、72 h各组间数据进行比较,各时间段生物膜内残余细菌量为空白对照组>乙酰半胱氨酸组>万古霉素组>万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组>万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组,各组间差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组生物膜内残余细菌量

2.4 N-乙酰半胱氨酸联合万古霉素对MRSA细菌生物膜结构和形态影响扫描电镜结果(图3)显示:空白对照组的载体表面周围存在大量的黏液状胞外分泌物黏附,大量MRSA菌黏附于生物膜内外。万古霉素组MRSA菌黏附较空白对照组明显减少,但仍可见大量的残余胞外分泌物黏附于载体表面,构成生物膜结构。乙酰半胱氨酸组胞外分泌物明显减少,黏附细菌数量较空白对照组明显减少,部分细菌呈单个黏附。万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组黏附细菌数明显减少,黏附细菌周围的胞外分泌物也明显减少,未见明显簇拥呈团块状的细菌。万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组中黏附细菌数进一步减少,未见片状细菌生物膜存在。

图3 扫描电镜下各组生物膜形态

激光共聚焦结果(图4)显示:经SYTO9及PI染色后,在激光共聚焦下观察活菌呈绿色荧光,死菌呈现为红色荧光。活/死细菌重叠处呈黄色。空白对照组:活菌为主,伴有部分死菌共同形成细菌生物膜。万古霉素组:存在大量死菌,但是伴较多的活菌存在于其中。乙酰半胱氨酸组:可见较多活菌,死菌较少,但活/死细菌黏附面积明显减少。万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组:活/死细菌黏附数量均较前减少,大多数活菌呈单个分布,未见片状分布的活/死细菌。万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组:活/死细菌黏附数量均进一步减少,活菌呈单个分布。

图4 激光共聚焦下各组生物膜结构

3 讨论

假体周围感染作为人工关节置换术后最严重的并发症之一,其治疗手段一直是关节外科的研究热点和攻克的重点难点[12-13]。临床针对假体周围感染翻修最主要的治疗手段是手术清创联合抗生素治疗[14-15]。由于细菌生物膜的存在,即使是清创术联合抗生素的治疗后,仍然存在感染复发的可能[16]。因此细菌生物膜的彻底清除是假体周围感染翻修治疗成功与否的关键所在。

在临床中,抗生素的局部应用确实能在很大程度上降低感染的发生,且存在多个优势:局部药物浓度高,可快速达到杀菌浓度;可减少全身不良反应;提高药物利用率等[17]。研究证实,高于10 mg/mL浓度的万古霉素可能会导致骨细胞的凋亡[18]。考虑到局部用药浓度[19],本研究中采用的万古霉素浓度为5 mg/mL。在NAC对细菌生物膜的作用相关研究中,Eroshenko等[20]证实NAC对部分葡萄球菌株的最低抑菌浓度(MIC)为25 mg/mL,在0.5 MIC浓度时可对部分葡萄球菌的生物膜产生清除作用。Kuruoglu等[21]对置入导管表面的细菌生物膜感染研究中,发现6 mg/mL的NAC对生物膜清除起到了一定的清除作用。因此在此次实验中低高剂量组分别加用浓度为5 mg/mL和20 mg/mL的NAC。

通过对结晶紫染色的结果分析,发现空白对照组及万古霉素组的生物膜面积高于乙酰半胱氨酸组、万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组及万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组,且不同浓度NAC联合万古霉素使用时,生物膜面积也存在着显著差异(P<0.01)。共聚焦观察发现,空白对照组、万古霉素组存在大量死菌构成的细菌生物膜黏附。万古霉素作为MRSA菌的敏感抗生素,其单独应用即使在较高浓度下维持72 h仍然有较多的细菌存活,结合较多的生物膜面积,推测生物膜的形成影响了万古霉素对MRSA菌的杀灭作用。在万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组和万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组中,生物膜面积和活/死细菌均有着较高的清除率,且随着NAC浓度的增加,构成生物膜的活/死细菌黏附数量进一步减少。结晶紫染色及激光共聚焦观察从生物膜面积和构成生物膜的活/死细菌比例上初步证实NAC与万古霉素的联合应用可有效减少生物膜的产生,提高对生物膜及细菌的清除效果。

扫描电镜结果显示,空白对照组细菌团状聚集黏附于致密的生物膜表面;万古霉素组生物膜结构无明显改变,但黏附的细菌数量减少,同时可见部分细菌分布于生物膜内;乙酰半胱氨酸组可见胞外分泌物明显减少,黏附细菌数量较空白对照组明显减少,部分细菌呈单个黏附。在万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组和万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组中,细菌与生物膜进一步减少,证实NAC可有效减少生物膜的产生,使MRSA菌无法通过生物膜屏障对抗抗生素的渗透,显著提高了抗生素对细菌的杀灭作用。

通过超声裂解生物膜[22],并以LB-琼脂培养板计数法对生物膜内细菌定量的实验中,乙酰半胱氨酸组细菌定量结果在48和72 h均有增加,说明NAC本身抑菌效果不强。导致乙酰半胱氨酸组比空白对照组生物膜内细菌定量减少的原因为乙酰半胱氨酸组内生物膜面积减少,细菌黏附率降低,未黏附的浮游细菌在实验中被冲洗消除。万古霉素组中生物膜内MRSA菌数量随时间的增加持续减少,但持续应用72 h后仍然有较多的残余。万古霉素+乙酰半胱氨酸低剂量组和万古霉素+乙酰半胱氨酸高剂量组生物膜内残余细菌定量相比万古霉素组,MRSA菌的清除效果明显增加,且清除效果随NAC浓度呈剂量依赖性(P<0.01)。多时段的细菌定量分析证实NAC与万古霉素的联合应用可加强万古霉素对MRSA菌的清除作用。

本研究通过在体外建立MRSA菌生物膜,多种方法共同证实NAC与万古霉素的联合应用可以有效清除细菌生物膜,并显著增加生物膜内细菌的清除率。由于此研究为体外实验,生物膜生长及干预环境可控性强,变量单一,与体内环境中复杂的生物膜感染环境存在着一定的差异。同时假体周围感染的治疗过程中,局部用药有着浓度高、药物半衰期不同于体内代谢等特点,应在后期通过建立假体周围感染动物模型[23],进一步证实NAC在体内环境中的作用效果,并探寻其调控机制及可能存在的靶点,阐明其作用机制,为假体周围感染的治疗提供理论依据。