食源性细菌检测中实时荧光定量PCR技术的应用效果研究

杨帆（天津市静海区疾病预防控制中心,天津 301600）

食品是人类赖以生存及发展的物质基础，而食物安全问题更是关系到人体健康及民生的重要社会问题之一，已经引起了人们的高度重视。近些年来，我国因世界范围内大规模生物污染所导致的食源性疾病暴发事件在日常生活中屡见不鲜。例如奶粉中含有金黄色葡萄球菌、日本出血性大肠埃希菌污染、法国李斯特菌中毒以及世界范围内的SARS流行等[1]。生活中所涉及的食品污染总共分为三类，第一类为化学性污染，主要是重金属污染物、化学残留物等；第二类为物理性污染，表现为放射性物质对食品的污染；第三类在生活中最为常见，为昆虫、寄生虫、微生物等对食品的污染。据权威数据统计，全世界每年会有15亿以上的腹泻患者，其中有70%的患者是因食用了被微生物污染的食品而发病的。我国则是以细菌毒素及细菌所造成的污染危害最大[2]。其中细菌感染型中毒潜伏时期较长，通常为十余个小时，且伴有发烧症状；而毒素型中毒时间仅为2-4个小时，很少会出现发烧的问题。从检测方式上看，目前包括我国在内的许多国家仍有部门应用传统的细菌培养鉴定方式对食源性致病菌进行检测[3]。这类检测方式的不足之处在于灵敏度低、操作繁琐及检测周期长，因此细菌检测方式在临床上应用则显得尤为滞后。因此需要引入一类特异性及敏感性均较强的检测方式进行检测，这对于明确致病菌的类型以及促进早期诊疗的开展均有着可观的临床应用价值。笔者引入了基于分子生物学的FQ-PCR检测技术，最终取得了较为可观的检出结果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象资料 抽取天津市静海区疾病预防中心2021年5月-2022年5月之间发生群体食源性中毒腹泻和疑似患者共计100例，分别取其粪便标本60份，呕吐物标本40份，共计100份标本作为研究材料，对其中所含有的食源性致病菌进行测定。

1.2 方法 （1）仪器及试剂：PCR扩增仪为美国某公司生产，分析软件由厂家提供。另选取试剂包括FQ-PCR荧光染料、DNA聚合酶、细菌基因组提取试剂盒、离心机。（2）细菌培养检测方式：金黄色葡萄球菌、沙门菌、志贺菌及副溶血性弧菌均按照国家标准的细菌培养法和自动化微生物分析仪进行测定。（3）FQ-PCR检测方式：①热裂解法提取样本DNA：取细菌培养液10ml置于试管中，按照8000r/min的速率进行离心。将其灭菌后应用蒸馏水进行2次洗涤。然后应用1ml蒸馏水进行悬浮处理，最后将样本用水煮沸10min，按照8000r/min进行离心，取上清液，即为DNA模板液。②PCR扩增：在PCR扩增仪上进行扩增检测，并按照说明书要求分别配置扩增液，调节循环参数。

1.3 观察指标 ①FQ-PCR试剂盒特异性分析：选取导致食源性中毒的6个特异性菌株与导致食源性中毒的14个无关菌株各5份作为检测样本，计算FQ-PCR试剂盒的特异性水平。②FQ-PCR试剂盒的灵敏度及线性范围：将本次检测所分离鉴定出的菌株进行分离检测，按照初始浓度2×107cfu进行10倍梯度稀释，然后按照上述方法中所提及的方式进行PCR扩增。对照方式采用平板培养法，组中测算出试剂盒的线性范围及灵敏度水平。③不同方式检出结果：比较细菌培养法及FQ-PCR法对沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、诺如病毒及轮状病毒的检出率，并将结果以百分比形式表达。

1.4 统计学分析 借助SPSS26.0软件进行数据分析，计量资料组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05表示数据存在比对价值。

2 结果

2.1 FQ-PCR技术灵敏度 通过定量对照模板进行10倍稀释，并取7个浓度（2×10-2×107拷贝/ml），并对其进行实时定量PCR方式检测。最终测定结果显示，模板在2×102-2×107拷贝/ml范围之间与其对应的CT值具有良好的相关性，相关系数大于＞0.999。即为FQ-PCR方式能够对2×102-2×107拷贝/ml之间的食源性细菌病原体进行精准定量测量。具体相关性曲线图详见图1。

图1 FQ-PCR技术灵敏度相关性曲线图

2.2 细菌培养法阳性检出结果 由表1可知，细菌培养法共检出沙门菌5份、志贺菌41份、副溶血性弧菌5份、金黄色葡萄球菌6份、诺如病毒5份、轮状病毒1份，总阳性检出数63份，总阳性率为63.00%。

表1 细菌培养法阳性检出结果

2.3 FQ-PCR法阳性检出结果 由表2可知，FQ-PCR法共检出沙门菌7份、志贺菌58份、副溶血性弧菌10份、金黄色葡萄球菌9份、诺如病毒7份、轮状病毒1份，总阳性检出数92份，总阳性率为92.00%。

表2 FQ-PCR法阳性检出结果

2.4 不同方式检测结果比较 FQ-PCR法阳性检出份数为92份，细菌培养法阳性检出样本份数为63份，差异有统计学意义（χ2=24.114，P=0.000）。

3 讨论

食品在生产、运输、销售的各个环节中很容易受到微生物的污染。故在当前的食品卫生检验工作中，非常重要的一个要求即为准确、及时地将食品中的有害微生物予以检出，避免有害食物流向市场。当前，随着人们生活水平及保健意识的不断提升，大众对于食品卫生安全的关注度也在与日俱增。因此，需要在食品生产的各个环节中均进行检测，保证食品在生产过程中的安全，使食品食用时的安全性得到有效保障。

从检测手段上看，传统的微生物检测方式主要是根据食品的生理性状及形态特征进行细菌分离、培养及一系列生化反应的检测方式。检测步骤用时较长，且操作比较繁琐，特别是部分细菌往往不能得出理想的鉴定结果，同时在细菌检测的实际应用过程中，还会出现结果出具时间与实际需求不匹配的情况。当前随着食品细菌检测技术应用的不断增多，临床上可应用的细菌检测方法与手段也变得愈发多元化，可应用的检测仪器也越来越灵敏。如何采用准确、经济且快捷的检测方式为当前食品安全检测需重点关注的问题。从当前的发展趋势上看，食品检测需要体现出快速、准确的特点。在食品运输的过程中，进出口商检、质检人员、质控人员及食品生产经营企业都需要政府部门能够在短时间内取得准确且及时的质控结果。故应用一类省力、省时且成本低的检测方式是社会各界所迫切需要的。

本次研究中则是在常见的食源性病毒检测中引入了FQ-PCR技术作为支持，最终检测结果较为可观：FQ-PCR法阳性检出份数为92份，高于细菌培养法阳性检出样本份数，差异有统计学意义（χ2=24.114，P=0.000）。这一结果说明，应用FQ-PCR技术相较于细菌检测技术对食源性细菌的检出率更高。对本次研究中所涉及的检测菌种进行分析：①沙门菌属：其属于导致食物中毒最常见的致病菌类型，位居我国食物中毒的第一位菌种。食源性中毒所感染的菌种一般是由猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌所引起的。当菌种进入到肠道中，则会大量繁殖，使得肠道黏膜发炎。在反应过程中，大量活菌释放所产生的内毒素还将导致患者机体出现中毒的表现。该菌种为出入境检疫、畜牧兽医、食品卫生、公共卫生检测中的重要指标之一，属于必检项目之一。当前临床上主要是将沙门氏菌的ssaN，invA基因作为靶基因，建立FQ-PCR的方式进行检测。也有学者试着将ivnA mRNA作为模板，结合反转录PCR技术，也在一定程度上提升了活菌检测结果的准确性[4]。②志贺菌：该菌种属于细菌性痢疾中最常见的病原菌类型。各型痢疾杆菌均能够释放出强烈的内毒素，而内毒素在作用到肠壁时，则会使得肠壁的通透性增高，进一步促进机体吸收内毒素，导致患者出现中毒性休克、神经障碍及发热等表现。此外，脓血便产生的原因即为内毒素作用于肠壁神经系统，导致患者出现一种里急后重、肠道损伤症状。有学者通过将志贺菌CssrB基因的一段特异性核酸序列为靶标，并将设计带有FAM荧光基团标记的发卡探针为对象，最终验证该检测方式能稳定、灵敏地检测出志贺菌，为该菌种诊断提供了一类全新的方式[5]。③副溶血性弧菌：该菌种涉及的食品主要为海产品（贝类、蟹类、鱼虾）等制品，是由其直接或间接污染所导致。据权威数据显示，在海产品中，副溶血性弧菌的带菌率可高达45%以上。而引起食物中毒的季节主要在夏秋之间，属于食源性疾病中最常见的致病微生物之一。而在人们生活质量不断提升的今天，人们所食用的海产品数量也在不断增加，故因该菌感染所中毒的患者数量也在不断增加。当前主要将其中的gyrB、toxR、trh、tdh基因作为靶基因进行的FQ-PCR检测。有学者将位于toxR基因上的特异性片段作为靶基因，并应用PGM-T为载体构建重组质粒，最终结果显示，这类检测结果灵敏度较佳，为40拷贝/反应体系，且变异系数较低，均为5%以下[6]。④金黄色葡萄球菌：该菌种是一种广泛存在于自然界中的革兰阳性菌类型，是导致细菌性食物中毒发病的主要致病菌之一。该菌种可通过与空气接触的方式传播对食品造成污染。据权威数据统计显示，金黄色葡萄球菌能在多种食品中检出，污染范围较为广泛。若是食物本身的加热温度不够，食物中的菌种未能被有效杀死，可能导致食物中毒发生。从检测手段上看，传统的平板和血平板检测法检测存在灵敏度低、耗时长及可能产生假阳性检测结果的问题。应用FQ-PCR检测技术时，则主要以金黄色葡萄球菌中的耐热核酸酶基因、肠毒素作为靶基因，能够起到提升检出率的效果。也有学者引入了免疫磁性分离、基质增融等的样本前处理方式，分析其对实验结果的影响。结果发现基质增容及浮选法可允许在1-10CFU/ml的细胞中进行定量检测，这能使低浓度样本情况下细菌的检出率得到有效提升[7]。⑤诺如病毒又被称为脓融病毒，该病菌在全年均可感染，且在冬季发生感染的概率最高。大多数患者发病是因食物中毒所引起的腹泻导致。该病毒能够通过被感染者污染的粪便、飞沫接触、未煮熟的贝类、海鲜、食物、被污染的水源等传播。从感染的人群上看，孩子、老人等体质比较弱的人最容易感染。由于感染诺如病毒后，患者自身腹泻的症状及临床表现是有所差异的，故在致病菌分辨及检查上需进行严格划分，避免出现误诊误治的情况发生。一般临床上进行FQ-PCR检测时的靶基因为诺如病毒GI型和GⅡ型靶基因ORF1及ORF2[8]。⑥轮状病毒感染在2岁以下的婴幼儿中较为常见。发病后患者的早期症状主要包括呕吐及发热等，随后将出现腹泻的症状，甚至出现脱水的表现。该病毒对机体多个脏器均有影响。该病属于自限性疾病类型，自然病程5-8天，属于婴幼儿常见致死病因。一般临床上进行检测时的基因是对轮状病毒NSP5靶基因保守区域设计多对引物，利用探针筛选[9]。

从检测原理上分析，FQ-PCR技术是在常规PCR技术上所发展出来的一种高灵敏度核酸定量技术。该技术是在荧光染料激发的作用下利用荧光的光能变化，直接将PCR扩增产物量的变化予以反应[10]。本次结果显示，研究中所应用的技术能够检测低浓度拷贝下的病原体核酸。而分子信标技术的应用，也使得FQPCR检测方式的灵敏度得到了较大的提升。此外，从检测准确度上看，由于FQ-PCR技术是在完全封闭的条件下进行的，能够防止外源性因素对PCR反应产物产生影响，故提升了检测结果的准确性。同时，PCR检测仪进行数据分析的过程均是自动的，无需引入如紫外线灯观测及电泳等步骤，仅需0.5-1.2h即能够将整个PCR技术流程完成，显著提升了检测效率[11]。FQ-PCR检测的PCR法与定量扩增是同步进行的，克服了PCR的平台效应，有效地打破了传统PCR仅能进行终点检测的局限性。而其应用PMA技术作为DNA嵌入试剂，还能够将死亡细菌的DNA予以清除，从源头上避免了假阳性情况的发生。

综上所述，在食源性细菌检测中引入FQ-PCR检测技术，相较于传统的细菌检测方式，能够有效提升检出率，具有一定的临床应用价值。