紫铆因通过调控miR-487a-3p表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭的机制

李彬 阮剑 袁媛 宁晓洁 赵建国

(武汉市中西医结合医院 武汉市第一医院甲乳外科,湖北 武汉 430022)

乳腺癌是一种临床常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率较高,寻找副作用少的新药是当下抗肿瘤药物领域研究的重点,中药具有多成分多靶点的特点,是治疗乳腺癌的重要手段〔1,2〕。紫铆因又名紫铆查尔酮,是一种从漆树中分离出来的植物多酚类物质,作为传统中草药具有多种药理活性,如抗氧化、抗肿瘤〔3〕。报道显示,紫铆因可以抑制宫颈癌细胞Hela的增殖,促进其凋亡〔4〕。紫铆因可以通过抑制PI3K-Akt信号通路促进U2OS骨肉瘤的凋亡并抑制其侵袭转移〔5〕。紫铆因可通过减少细胞内活性氧的产生来抑制乳腺癌的生长〔6〕。紫铆因可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖〔7〕。然而紫铆因对乳腺癌细胞的影响及其潜在的分子机制及作用靶点仍需进一步的研究验证。研究报道miR-487a-3p在胰腺癌〔8〕和前列腺癌〔9〕组织中低表达,过表达miR-487a-3p可抑制胰腺癌、前列腺癌细胞增殖和迁移。然而miR-487a-3p对乳腺癌细胞生物学行为的影响及紫铆因之间的联系仍未可知。本实验重点考察紫铆因在乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和miR-487a-3p表达中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1临床资料 采集武汉市第一医院2018年1月至2020年12月乳腺癌患者(43例)的癌组织及癌旁组织(距离癌组织边缘5 cm),年龄29～78岁,平均(52.7±2.1)岁;经手术切除癌组织,患者均知情且同意。本研究患者或家属均签署知情同意书并由医院伦理委员会批准。

1.2细胞与主要试剂 MDA-MB-231细胞(美国ATCC);紫铆因(纯度≥98%,无锡云萃生物科技有限公司);甲基噻唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司);放射免疫沉淀分析法(RIPA)蛋白裂解液、结晶紫(北京百奥莱博公司);RNA提取及荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.3细胞分组与处理 RPMI1640培养基培养MDA-MB-231细胞并将细胞分为对照组(正常培养)、紫铆因-低、中、高组(给予10、20、40 μmol/L的紫铆因处理48 h)、miR-NC组(将miR-NC转染至MDA-MB-231细胞)、miR-487a-3p组(将miR-487a-3p模拟物转染至MDA-MB-231细胞)及紫铆因+anti-miR-NC组(将miR-487a-3p抑制剂的阴性对照转染至MDA-MB-231细胞后,用40 μmol/L的紫铆因处理48 h)、紫铆因+anti-miR-487a-3p组(将miR-487a-3p抑制剂转染至MDA-MB-231细胞后,用40 μmol/L的紫铆因处理48 h)。

1.4细胞增殖活性检测 在96孔板上接种各组MDA-MB-231细胞(每孔5 000个细胞,含100 μl培养基),孵育48 h,加入MTT试剂(20 μl/孔),再孵育4 h;然后弃去培养基,加入二甲基亚砜(150 μl/孔)使晶体完全溶解,10 min内用酶标仪测量每孔的吸光度(OD)值,检测波长570 nm,计算细胞增殖抑制率(%)。

1.5克隆形成实验 在6孔板中培养各组MDA-MB-231细胞(1 000个/孔),生长2 w形成集落后,用4%多聚甲醛固定15 min,并用0.1%结晶紫染色30 min,观察并计数>50个细胞的克隆数。

1.6划痕愈合实验 各组MDA-MB-231细胞接种于6孔板中,培养过夜细胞铺满孔底后,用无菌移液管尖端在细胞单层上划一条线,然后更换培养基进一步培养48 h。在培养0 h和48 h时对划痕进行拍照并用Image-Pro Plus6.0软件对划痕宽度进行量化,计算划痕愈合率。

1.7Transwell小室实验 将1×104个细胞在无血清培养基中重悬,取100 μl细胞悬液接种到Transwell上室(有基质胶包被),600 μl完全培养基加入下室。孵育24 h后去除上表面剩余细胞,侵入的细胞用4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色。显微镜下计算5个视野的侵袭细胞数。

1.8Western印迹法检测MMP-2、MMP-9蛋白表达 用RIPA裂解缓冲液提取各组细胞总蛋白,50 μg蛋白样品用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转膜,然后用5%脱脂奶粉封闭膜1 h;将膜与一抗基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)4 ℃孵育过夜,与二抗在室温下反应1 h,增强化学发光试剂使条带可视化,分析条带灰度值,计算目的蛋白相对表达量。

1.9RT-qPCR分析miR-487a-3p表达 使用Trizol试剂提取组织/细胞总RNA,使用miRcute miRNA-cDNA Kit通过逆转录反应合成单链互补DNA(cDNA),然后在实时PCR仪上扩增miRNA,采用2-ΔΔCt法分析miR-487a-3p相对表达量,U6为内参。

1.10统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1紫铆因抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖 与对照组比较,紫铆因-低、中、高组细胞增殖抑制率显著升高,克隆形成数显著减少,呈显著浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖、迁移、侵袭能力及miR-487a-3p水平比较

2.2紫铆因对miR-487a-3p表达的影响 与对照组比,紫铆因低、中、高组miR-487a-3p水平显著升高,呈显著浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

2.3紫铆因对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的影响 与对照组比,紫铆因-低、中、高组划痕愈合率、侵袭细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低,呈显著浓度依赖性(P<0.05)。见图1、图2、表2。

1～8:对照组、紫铆因-低组、紫铆因-中组、紫铆因-高组、miR-NC组、miR-487a-3p组、紫铆因+anti-miR-NC组、紫铆因+anti-miR-487a-3p组;图2同图1 紫铆因对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

表2 miR-487a-3p过表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭

2.4miR-487a-3p在乳腺癌组织中的表达 乳腺癌组织中miR-487a-3p的表达水平显著低于癌旁组织(0.37±0.04 vs 1.00±0.10,n=43,t=30.373,P<0.05)。

2.5miR-487a-3p过表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭 与miR-NC组比,miR-487a-3p组miR-487a-3p水平、增殖抑制率显著升高,克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05)。见图1、图2、表2。

2.6抑制miR-487a-3p表达逆转了紫铆因对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移侵袭的影响 紫铆因+anti-miR-487a-3p组相较于紫铆因+anti-miR-NC组,miR-487a-3p水平、细胞增殖抑制率显著降低,克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图1、图2、表3。

表3 抑制miR-487a-3p表达逆转了紫铆因对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭的作用

3 讨 论

在乳腺癌治疗中,中医药是重要手段之一,其可多层次、多途径抑制肿瘤,且毒副作用小,阐明中医药的具体作用机制,可以更好地发挥其效用〔10〕。紫铆因作为一种传统中药,具有抗肿瘤作用,如紫铆因可通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的活化抑制人胃癌细胞增殖〔11〕。紫铆因可抑制人胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡〔12〕。紫铆因可通过下调雌激素受体(ER)α抑制乳腺癌生长〔13〕。以上研究表明紫铆因对多种肿瘤均具有抗癌作用。本实验结果发现紫铆因可浓度依赖性地抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移侵袭,提示紫铆因具有抗对乳腺癌生长的作用。

miR-487a-3p属于miRNA的一种,参与肿瘤的发生发展过程;研究报道miR-487a-3p通过靶向PPM1A抑制口腔鳞状细胞癌的生长和侵袭〔14〕。miR-487a-3p可通过抑制TM4SF1的表达抑制肾癌细胞ACHN的增殖和侵袭〔15〕。本实验结果显示,乳腺癌组织中miR-487a-3p的表达水平显著低于癌旁组织,过表达miR-487a-3p可降低MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并降低MMP-2、MMP-9表达;表明过表达miR-487a-3p可抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭,提示miR-487a-3p可能在乳腺癌中起抑癌作用。此外,本实验发现紫铆因可上调miR-487a-3p表达,敲低miR-487a-3p可明显减弱紫铆因对MDA-MB-231细胞恶性行为的抑制作用。

总之,紫铆因可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与上调miR-487a-3p表达有关。