银杏叶提取物基于TLR4/NF-κB通路对动脉粥样硬化性脑梗死大鼠的干预效果

梅花 陈小进 刘宏达 邵祥忠

(海安市人民医院神经内科,江苏 海安 226600)

脑梗死主要由动脉粥样硬化所导致,在老年人中具有较高发病率,可对患者身心健康造成较大影响,并给家庭带来较大负担〔1,2〕。动脉粥样硬化可使患者局部血流中断,引发患者脑组织缺血、缺氧,发生坏死。临床治疗该病的药物疗效较差,故寻找新的治疗方法较为重要。银杏叶提取物具有抗炎、清除自由基、抗氧化的作用,在脑梗死的治疗中具有较好效果〔3〕。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路在炎症反应、免疫损伤中作用较为重要,损伤相关分子可使TLRs表达激活,并诱导NF-κB移至细胞核,促进体内炎症因子的释放,加重机体内炎症反应〔4,5〕。临床暂未有研究显示银杏叶提取物通过调控TLR4/NF-κB信号通路对动脉粥样硬化性脑梗死造成影响,本文分析基于TLR4/NF-κB信号通路探究银杏叶提取物对动脉粥样硬化性脑梗死大鼠的干预效果,以明确银杏叶提取物与动脉粥样硬化性脑梗死的关系。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取SPF级6～8周龄SD大鼠60只,体质量(221.42±16.32)g,购自广州锐格生物科技有限公司,动物许可证号:SYXK(粤)2021-0259,所有大鼠在室温(22.44±2.18)℃、在湿度65%下饲养,每日光照12 h,饲养期间自由饮水。本次实验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行。

1.2分组与建模 将60只大鼠中10只大鼠作为对照组,其余50只大鼠参照刘刚等〔6〕研究中动脉粥样硬化性脑梗死大鼠的建立方法构建模型,在大鼠腹腔内注射400 mg/kg的4.0%水合氯醛进行麻醉,将大鼠颈内动脉、右侧颈总动脉、颈外动脉进行分离,并结扎剪断颈外动脉,采用动脉夹夹闭颈内动脉,使用丝线打结阻断右侧颈总动脉,将颈外动脉切口剪开,注射荧光微球混选清液,形成动脉多发性阻塞,大鼠出现右侧Horner征即为建模成功。共有40只大鼠建模成功,随机分为模型组、低剂量组、高剂量组、药物对照组各10只。

1.3给药干预 建模成功后,开始给药。对照组、模型组给予生理盐水进行灌胃,低剂量组给予生理盐水+50 mg/kg银杏叶提取物进行灌服,高剂量组给予生理盐水+100 mg/kg银杏叶提取物进行灌服,药物对照组给予生理盐水+4 mg/kg丁苯酞进行灌服,1次/d,连续灌胃4 w。

1.4样本采集 采集大鼠静脉血2 ml,以转速3 000 r/min、离心15 min,分离上层血清,于-80 ℃保存。

1.5病理组织学观察 将大鼠断颈处死,取大鼠脑组织,剪取0.5 g储存于-80 ℃,在多聚甲醛中固定4 h,采用乙醇对其进行脱水处理,后进行石蜡包埋,制作5 μm薄片,进行脱蜡、脱水操作,并采用苏木素-伊红(HE)染色试剂盒进行染色,光学显微镜观察其病理变化。

1.6神经行为、脑梗死体积检测 采用Zea-Longa法评估神经功能,0分:活动正常且未出现神经功能缺失症状;1分:前肢无法完全伸展;2分:向左侧转圈;3分:左侧倾倒且无法自行行走。取大鼠脑组织,切除小脑、嗅球,制作2 mm间距冠状切片,放入2%氯化三苯基四氮唑染液中,37 ℃下放置30 min,多聚甲醛中固定4 h,观察大鼠脑梗死体积。

1.7氧化应激指标、炎症因子水平检测 取各组大鼠冷冻血清解冻,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、肿瘤坏死因子(TNF)-ɑ、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平,使用碳酸盐缓冲液,将待测液稀释,后倒入孔中,4 ℃下过夜处理,后弃去,洗净,孔中加入1%牛血清白蛋白(BSA),37 ℃孵育60 min,后弃去,洗净,稀释抗血清,每孔加入0.1 ml,37 ℃下进行轻微摇晃40 min,后弃去,冲洗干净,使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)进行显色处理,后在450 nm波长下检测吸光度(OD)值。

1.8TLR4、NF-κB mRNA检测 取大鼠脑组织,放入液氮中研磨,使用Takara逆转录试剂盒逆转录为cDNA,采用实时荧光定量法进行鉴定TLR4、NF-κB表达量,采用Primer5.0软件设计引物序列,反应体系:模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物、20 μl蒸馏水。反应条件:95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,共进行35个循环,采用2-ΔΔCt方法计算出TLR4、NF-κB表达量。TLR4上游、下游引物序列分别为:5′-TGCTCAGACATGGCAGTTTC-3′、5′-TCAAGGCTTTTCCATCCAAC-3′;NF-κB上游、下游引物序列分别为:5′-AACACTGCCGAGCTCAAGAT-3′、5′-CATCGGCTTGAGAAAAGGAG-3′;内参甘油醛-3-磷酸脱氧酶(GAPDH)上游、下游引物序列分别为:5′-CCTCACCCTTCCCCAATAAT-3′、5′-GTGTGA-ATGGTGCCTGTGAC-3′。

1.9TLR4/NF-κB蛋白检测 取各组脑组织,冰上溶解,25 min后制作组织匀浆,后取0.1 g匀浆加入检测试剂提取液,摇晃均匀,分离上层血清,使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒对TLR4、NF-κB蛋白含量进行检测,定量分析蛋白表达情况。试验重复5次。

1.10统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组组织学观察比较 对照组海马组织结构完整、清晰,可见细胞核;模型组海马组织发生变化,细胞减少,结构发生破损,神经细胞出现空泡;低剂量组、高剂量组、药物对照组细胞损伤减轻,神经细胞出现空泡数量减少,细胞形态较为完整。见图1。

图1 各组海马组织学(HE染色,×100)

2.2各组神经行为、脑梗死体积对比 与对照组相比,其余4组神经行为评分、脑梗死体积显著升高;与模型组相比,低剂量组、高剂量组、药物对照组上述指标显著降低;与低剂量组相比,高剂量组、药物对照组上述指标显著降低;与高剂量组相比,药物对照组上述指标显著升高(均P<0.05)。见表1。

表1 各组神经行为、脑梗死体积、氧化应激指标及TLR4、NF-κB mRNA及蛋白表达量对比

2.3各组氧化应激指标对比 与对照组相比,其余4组MDA水平升高,SOD、CAT水平降低;与模型组相比,低剂量组、高剂量组、药物对照组MDA水平降低,SOD、CAT水平升高;与低剂量组相比,高剂量组、药物对照组MDA水平降低,SOD、CAT水平升高;与高剂量组相比,药物对照组MDA水平升高,SOD、CAT水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.4各组炎症因子水平对比 与对照组相比,其余4组TNF-ɑ、IL-1β、IL-6水平升高;与模型组相比,低剂量组、高剂量组、药物对照组上述指标降低;与低剂量组相比,高剂量组、药物对照组上述指标降低;与高剂量组相比,药物对照组上述指标升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.5各组TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达量对比 与对照组相比,其余4组TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达量升高;与模型组相比,低剂量组、高剂量组、药物对照组上述指标降低;与低剂量组相比,高剂量组、药物对照组上述指标降低;与高剂量组相比,药物对照组上述指标升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1、图2。

图2 Western印迹检测各组TLR4/NF-κB信号通路

3 讨 论

脑梗死为多种原因导致的局部动脉血流减少,可使患者供血区脑组织缺氧、缺血,导致患者失语、偏瘫,损伤患者神经功能〔7,8〕。脑梗死发生后,体内细胞凋亡、炎症反应、氧化应激状态可对患者脑部损伤加重,造成恶性循环,使患者脑组织损伤范围扩大,故寻找减轻患者脑梗死的治疗策略较为重要〔9,10〕。

研究显示〔11,12〕,脑梗死可使患者氧化应激损伤加重,导致患者内皮细胞发生损伤,使患者病情加重。MDA为脂质过氧化最终产物,为酶系统、非酶系统产生的自由基,可使细胞代谢功能发生障碍,检测MDA表达水平,可反映出脂质氧化的严重程度,SOD在氧化应激反应中较为重要,可修复氧自由基对机体造成的损伤,SOD水平降低,表明患者体内氧化应激反应较为剧烈,血清CAT属于一种酶类清除剂,一般存在于组织内的过氧化体中或是红细胞中,可以将机体内过氧化氢分解成分子氧及水,并将过氧化氢(H2O2)清除,从而避免了H2O2对细胞的毒害〔13〕。

相关学者研究显示〔14,15〕,银杏叶提取物可调节动脉粥样硬化性脑梗死机体内氧化应激状态,银杏叶提取物为常见中药活性成分,其中主要成分银杏内酯、黄酮苷可改善体内血流动力学状态,并具有抗氧化的作用。该研究结果与本研究一致,表明采用银杏叶提取物干预,可减弱氧化应激反应,促使患者恢复。

脑组织血管闭塞后,可使缺血区发生炎症反应,分泌TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等多种炎症因子,使周围细胞发生死亡,对患者机体内血脑屏障造成破坏,使患者病变区域扩大,故对患者体内炎症反应进行控制,可使患者脑损伤进展得到控制,减轻患者血脑屏障损伤〔16,17〕。有关研究表明〔18,19〕,银杏叶提取物可使紧密连接蛋白表达水平升高,保护患者体内血脑屏障,组织大分子物质进入患者脑组织,抑制机体内炎症反应,保护患者神经功能。该研究结果与本研究一致,表明采用银杏叶提取物进行干预,可修复血脑屏障,控制脑损伤,减轻体内炎症反应。

TLR4为免疫受体,在脑缺血引起的炎症反应中具有重要作用,脑梗死的发生可激活大量小胶质细胞,损伤机体内神经细胞,释放高迁移率族蛋白(HMG)B1受体,HMGB1受体与TLR4结合后,可使TLR4通路发生传导,加重患者病情〔20〕。TLR4可与IL、接头蛋白发生结合,使TNF受体相关因子(TRAF)6磷酸化为转化生长因子β活化激酶(TAK)-1,释放NF-κB,NF-κB转移至细胞核后,可生成TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等细胞因子,促进炎症反应〔21〕。相关学者研究显示〔22,23〕,银杏叶提取物可减轻患者神经损伤,使TLR4、NF-κB表达降低,抑制TLR4/NF-κB通路的发展。该研究结果与本研究一致,表明银杏叶提取物可抑制TLR4/NF-κB通路,促使脑梗死大鼠恢复。