基于cGAS-STING 通路探讨知母皂苷元对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤保护作用

汪洋，张辉，伍冬冬，王静，吴秋歌

郑州大学第一附属医院 呼吸与危重症医学科，河南 郑州 450052

急性肺损伤是由诸多致病因素导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤进而引发的急性低氧性呼吸功能不全，致病因素包括感染、胶原血管病、药物作用、误吸、休克、急性嗜酸性粒细胞性肺炎、免疫介导的肺出血和血管炎以及放射性肺炎等[1]。早期临床表现为急性进行性加重的呼吸困难、呼吸窘迫、难治性低氧血症和非心源性肺水肿，进一步发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征，可导致呼吸衰竭和死亡。急性肺损伤的发病机制复杂，比较公认的是肺内炎症因子大量释放与激活使肺内炎症反应失控[2]。目前临床上尚无急性肺损伤的特效治疗手段，常规治疗主要是通过肺保护性通气策略、气道压力释放通气（APRV）、高频振荡通气（HFOV）、体外膜肺氧合（ECMO）和药物干预如糖皮质激素激素、β2受体激动剂、他汀类药物、骨髓间充质干细胞等限制其发展，减少肺内皮和上皮屏障的炎症[3-4]。另外，一些中药和天然活性成分通过抗炎和抗氧化应激作用在防治急性肺损伤中疗效显著[5-8]，且因天然活性成分药效明确、不良反应低，具有较好的临床应用前景。知母皂苷元是从中药知母中分离得到的有效成分，研究表明知母皂苷元具有抗肿瘤、抗阿尔茨海默病、抗凝血、降血糖、调血脂、抗炎等多种药理活性[9]。钟艳梅等[10]发现知母皂苷元可通过下调核因子-κB（NF-κB）-诱导型一氧化氮合酶（iNOS）-一氧化氮（NO）通路抑制脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7 细胞中炎症因子的释放发挥保护作用。鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路的激活在免疫炎症应答中的作用受到广泛关注。

本研究基于cGAS-STING 通路探讨知母皂苷元对脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用，为防治急性肺损伤药物的研究提供新的靶点和思路。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级昆明小鼠60 只（雌性，6 周龄，体质量18～22 g，西安交通大学医学部实验动物中心），许可证号SCXK（陕）2020-001。分笼饲养，自由饮食饮水，适应性喂养1 周后开展实验，动物实验经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号2020-KY-125）。

1.2 材料与仪器

1.2.1 药物与试剂 知母皂苷元（质量分数＞98%，成都普瑞法公司，批号BP1257）；LPS（美国Sigma公司，批号JP0284）；地塞米松磷酸钠注射液（辰欣药业公司，规格1 mL∶5 mg，批号1112136114）；小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（批号EEL-M0044）、小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（批号E-EL-M0049）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号E-BC-K318-M）、SDS-PAGE 凝胶试剂盒（批号E-IR-R305）均购于武汉伊莱瑞特生物公司；兔抗小鼠cGAS 抗体（批号ab252416）、兔抗小鼠STING 抗体（批号ab189430）均购于美国Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（批号A21020）购于武汉亚科因公司。

1.2.2 仪器 ME54E 型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏公司）；BX 53 OLYMPUS 显微镜（日本奥林巴斯公司）；MY-10 电动组织研磨器（上海净信公司）；M1324R 台式高速冷冻离心机（深圳市瑞沃德公司）；Infinite200 多功能酶标仪（瑞士帝肯公司）；通用型电泳仪（美国伯乐公司）；Amersham Imager 600 凝胶成像分析仪（美国通用电气公司）。

2 方法

2.1 动物分组、给药与造模

60 只昆明小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松组及知母皂苷元50、100、200 mg/kg 组。知母皂苷元50、100、200 mg/kg 组小鼠ig 给予相应剂量的知母皂苷元溶液，地塞米松组小鼠ip 地塞米松磷酸钠注射液0.5 mg/kg，对照组和模型组ig 等体积生理盐水，1 次/d，连续7 d。末次给药1 h 后，其余各组小鼠除对照组外均ip 10 mg/kg LPS 溶液复制小鼠急性肺损伤模型[11]。

2.2 肺组织湿/干质量比（W/D）测定

造模后6 h 取各组小鼠左肺组织，除去血渍后滤纸吸干，精密称量，即为湿质量；恒温干燥箱中放置24 h（80 ℃），烘干后称量，即为干质量，计算各组小鼠肺组织W/D。

2.3 苏木精–伊红（HE）染色法观察肺组织病理学

造模后6 h 取各组小鼠的肺组织，4%多聚甲醛固定，脱水、浸蜡、包埋、切片，脱蜡后进行HE 染色，利用光学显微镜观察肺组织病理形态学变化。

2.4 血清中IL-6、TNF-α 水平测定

造模后6 h 摘小鼠眼球取全血，3 500 r/min 离心10 min（4 ℃），分离上清，严格按照试剂盒说明书检测小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平。

2.5 肺组织中cGAS、STING 的蛋白表达测定

造模后6 h 取各组小鼠的肺组织，加入蛋白裂解液机械研磨，BCA 法进行蛋白定量。样品置于95 ℃水浴锅煮沸10 min，12 000 r/min 离心10 min（4 ℃），取上清上样后依次进行SDS-PAGE 电泳、转膜、1 脱脂牛奶封闭，再分别加入cGAS、STING、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，洗膜后加入ECL发光液显色，利用凝胶成像系统中成像，采用Image J 软件进行灰度分析。以目的蛋白与β-actin 的灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计处理，所有数据结果以表示，采用单因素方差分析进行组间比较，采用LSD 法进行两两比较。

3 结果

3.1 知母皂苷元对小鼠肺组织W/D 的影响

与模型组相比，地塞米松组及知母皂苷元200 mg/kg 组小鼠肺组织W/D 显著降低（P＜0.05）；知母皂苷元50、100 mg/kg 组小鼠肺组织W/D 呈降低趋势，差异无统计学意义，见表1。

表1 知母皂苷元对小鼠肺组织W/D 的影响（，n=10）Table 1 Effects of sarsasapogenin on lung W/D in mice(,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.2 知母皂苷元对小鼠肺组织病理学的影响

对照组小鼠肺组织结构清晰完整，肺泡壁无水肿、增厚、液体渗出等炎症表现，未见炎症细胞浸润。模型组小鼠肺泡壁明显增厚，有水肿、出血及少许液体渗出现象，且有大量炎症细胞浸润。地塞米松组和知母皂苷元各剂量组小鼠肺泡水肿、出血、渗出程度较模型组较轻，损伤情况均有所改善，见图1。

图1 知母皂苷元对小鼠肺组织病理学的影响（×200）Fig.1 Effects of sarsasapogenin on histopathological changes of lung in mice (× 200)

3.3 知母皂苷元对小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影响

与模型组相比，地塞米松组和知母皂苷元各剂量组小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 水平均显著降低（P＜0.05），且呈剂量相关性，见表2。

表2 知母皂苷元对小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影响（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

表2 知母皂苷元对小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影响（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.4 知母皂苷元对小鼠肺组织中cGAS、STING 蛋白表达的影响

与模型组相比，地塞米松组小鼠肺组织中cGAS、STING 的蛋白表达均有降低趋势，但差异无统计学意义；知母皂苷元各剂量组小鼠肺组织中STING 的蛋白表达均显著降低，知母皂苷元100、200 mg/kg 组小鼠肺组织中cGAS 的蛋白表达显著降低（P＜0.05），下降趋势呈剂量相关性，结果见图2、表3。

图2 知母皂苷元对小鼠肺组织中cGAS、STING 蛋白表达的影响Fig.2 Effect of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice

表3 知母皂苷元对小鼠血清中肺组织中cGAS、STING 蛋白表达的影响（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

表3 知母皂苷元对小鼠血清中肺组织中cGAS、STING 蛋白表达的影响（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

4 讨论

急性肺损伤是临床常见的急危重症，其病因极其复杂，一般分为肺内因素和肺外因素2 类，包括直接和间接导致肺损伤的疾病。急性肺损伤的发病机制极其复杂，目前认可度较高的发病机制是过度的炎症反应，促炎因子TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-18（IL-18）是临床上可能预测急性肺损伤发病率和死亡率的生物标志物[1]。其中，IL-6 是IL 家族的核心成员，能够调节细胞生长分化、急性期反应、免疫应答和造血功能的作用。促炎因子TNF-α 能直接杀伤肿瘤细胞，也能通过结合多种活性物质对组织造成间接损伤[12]，因此本研究选取IL-6 和TNF-α 作为评估急性肺损伤的检测指标。

急性肺损伤实验动物模型多采用LPS 诱导，该模型主要用于模拟临床中革兰阴性菌和感染性休克所致的肺损伤[13]。LPS 是革兰阴性菌细胞外壁的组成成分，注射LPS 会损伤机体毛细血管内皮细胞，造成血管壁通透性增加、细胞间质水肿，引起机体急性肺损伤，从而增加了炎性细胞因子的释放，诱发瀑布样级联反应，表现为全身炎症反应综合征[14]。本研究采用ip LPS 复制急性肺损伤小鼠模型，模型组小鼠注射LPS 后肺组织W/D 显著升高，TNF-α、IL-6 水平显著增加，肺组织有明显病理损伤，表明急性肺损伤小鼠模型建立成功。

cGAS-STING 通路介导细胞凋亡、自噬过程，参与多种疾病的发生发展，阻断cGAS-STING 通路可抑制炎症反应、减轻组织损伤，激活cGAS-STING通路可发挥促炎、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学效应[15]。本研究发现急性肺损伤小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平显著升高，肺组织中cGAS、STING 的蛋白表达显著升高，提示急性肺损伤小鼠的炎症反应可能与激活cGAS-STING 通路有关。经知母皂苷元预处理后，急性肺损伤小鼠TNF-α、IL-6 水平均显著降低，肺组织中cGAS、STING 的蛋白表达亦显著降低，表明知母皂苷元可通过抑制cGAS 和STING，减少促炎因子的释放，最终减轻LPS 诱导的急性肺损伤。研究表明，cGAS 通过识别、结合细胞质内的双链DNA 进而激活STING，在高尔基体上招募并激活TANK 结合激酶1（TBK-1），从而直接激活NF-κB 通路，诱导炎症因子的产生。TBK-1 也可招募并磷酸化下游干扰素调节因子3（IRF3），促进干扰素相关基因的表达，增加Ⅰ型干扰素的合成，从而增强机体免疫[16]。本研究中知母皂苷元可能通过激活cGAS-STING 通路，进而激活NF-κB 通路，促进TNF-α、IL-6 的产生，也可能通过磷酸化IRF3，促进干扰素的合成。但cGAS-STING 的调控机制较复杂，具体机制还需进一步探讨。

一些单味中药、中药复方及天然活性成分如酚类、黄酮类、萜类、皂苷类、生物碱类等具有显著的防治急性肺损伤作用，其作用机制与抑制炎症反应、减轻氧化应激、调节机体免疫等相关[17]。研究表明，皂苷类成分如甘草酸[18]、人参皂苷[19]、远志皂苷元[20]、柴胡皂苷[21]可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）、NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）、NOD 样蛋白3（NLRP3）通路发挥抗炎抗氧化作用从而对LPS 诱导的急性肺损伤发挥保护作用。本研究建立了LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型，发现知母皂苷元可通过抑制cGAS-STING 通路，减少TNF-α、IL-6 的释放，进而改善肺组织病理损伤，对急性肺损伤模型小鼠具有一定保护作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突