基于网络药理学与分子对接技术探讨齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的作用机制

张婉婉，张子建，张旭，张洁茹，王伟然，王春英,

1.河北医科大学 药学院 药物分析教研室，河北 石家庄 050017

2.河北省中医院 口腔科，河北 石家庄 050011

3.新疆科技学院 医学院，新疆 库尔勒 841000

牙周炎是一种慢性多因素炎症性疾病，与牙菌斑的堆积有关，其特征是牙齿支持器官的进行性破坏，包括对牙周韧带和牙槽骨的破坏[1]，其临床表现主要为牙龈炎症、牙槽骨吸收、牙周袋形成及牙齿松动[2]。作为全世界第6 大最流行的疾病，严重的牙周炎影响着大约10%的人口，牙周炎还被证实与心血管疾病、高血压、糖尿病、癌症和炎症性疾病在内的全身性疾病等多种系统性疾病的风险增加有关[3]。因此，其预防与治疗工作非常重要。

齿痛消炎灵颗粒由防风、牡丹皮、青皮、荆芥、青黛、地黄、白芷、甘草、细辛、石膏组成，具有疏风清热，凉血止痛的功效。用于脾胃积热、风热上攻所致头痛身热、口干口臭、便秘燥结、牙龈肿痛；急性齿根尖周炎、智齿冠周炎、急性牙龈（周）炎、急性牙髓炎见上述证候者[4]。临床上多与其他药物联合治疗牙周炎，且疗效确切，安全性好[5-7]。

随着生物信息学的快速发展，新兴的网络药理学以大数据库为基础，已成为从分子水平到途径水平详细描述复杂药物系统作用机制的有用工具[8]。网络药理学契合了中医整体哲学的核心思想，作为一种最先进的技术，该方法将研究范式从目前的一靶一药模式更新为新的“网络靶向多组分”模式。它通过提供详细的化合物-靶点和靶点-通路网络，有助于评价中药的合理性和配伍。本研究拟从网络药理学的角度出发，预测齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的药效成分和潜在靶点，并通过基因本体（GO）功能分析以及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析得到与齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎相关的信号通路和代谢途径，再通过分子对接技术验证活性成分与核心靶点的结合能力。为深入研究齿痛消炎灵颗粒的作用机制及药效物质基础提供了一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 齿痛消炎灵颗粒有效成分与靶点的收集

利用中药系统药理学数据库[9]（TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）平台检索齿痛消炎灵颗粒中防风、牡丹皮、青皮、荆芥、甘草、青黛、白芷、细辛、地黄、石膏10 味中药的成分，由于地黄在TCMSP 中检索不到，故利用ETCM 数据库[10]（https//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）进行补充，石膏为矿物药在数据库中检索不到，本研究暂不考虑。根据口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 的药动学（ADME）属性值筛选活性成分及其作用的蛋白靶点，并根据已发表的文献报道补充加入OB 值和DL 值相对较低，但在文献报道中提到的有明确的药理活性的5-O-甲基维斯阿米醇苷[11]、补骨脂素[12]、7-去甲基软木花椒素[11]、花椒毒酚[13]、丹皮酚[14]、橙皮苷[15]、柚皮苷[16]、薄荷酮[17]、胡薄荷酮[18]、环辛醇[17]、色胺酮[19]、甲基丁香酚[20]及其靶点。筛选后统一在Uniprot 蛋白数据库[21]（https://www.uniprot.org）将化合物作用的靶点进行规范。

1.2 牙周炎相关靶点的获取

以“periodontitis”为关键词，在GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https://www.omim.org/）、TherapeuticTargetDatabase数据库（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca/）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org）中进行检索及筛选靶点基因，得到与牙周炎相关的靶点，将搜集到的靶点合并并删除重复值。运用Venny 2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将齿痛消炎灵颗粒活性成分靶点与牙周炎疾病靶点取交集，得到齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的潜在靶点。

1.3 “中药–活性成分–靶点”网络及“化合物–靶点–疾病”网络的构建

将齿痛消炎灵颗粒的中药、活性成分、靶点及中药、化学成分与疾病共有靶点分别导入Cytoscape 3.9.1 软件，进行“中药-成分-靶点”“化合物-靶点-疾病”网络图的构建，利用Network Analyzer计算网络拓扑参数，包括degree 值、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将共有靶点上传至STRING 数据库（https://string -db.org），设定Organism 为“Homo sapiens”，设置靶点关联的置信度为0.40，以此构建靶点之间的PPI 网络，并将STRING 中得到的结果以TSV 格式下载并保存，导入Cytoscape 3.9.1 软件，利用其中的“Network Analyzer”功能进行网络拓扑分析。

1.5 GO 分析与KEGG 通路富集分析

将药物、疾病共同靶点导入Metascape 平台，分别进行GO 生物功能分析和KEGG 通路富集分析，设置P＜0.01，将获得的数据结果应用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn）进行可视化，并将排行前20 位的条目绘制成GO 生物功能分析柱状图和KEGG 通路富集分析气泡图。

1.6 成分–靶点–通路网络的构建

应用Cytoscape 3.9.1 软件构建“药物成分-靶点-信号通路”网络，然后应用网络分析仪Network Analyzer 功能获得各成分、靶点的网络拓扑参数，获得齿痛消炎灵颗粒发挥治疗牙周炎作用的重要活性成分及核心靶点。

1.7 分子对接评估

选取PPI 网络中degree 值排名前5 位的关键靶点和“中药-活性成分-靶点”中degree 值前5 位的核心成分作为受体蛋白和配体小分子。在PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中获取受体蛋白的晶体结构并下载其pdb 格式文件，从TCMSP 数据库下载配体小分子的MOL2 结构式，使用AutoDock Tools 1.5.6 对配体和受体进行分子对接，并使用Pymol 将分子对接结果可视化。

2 结果

2.1 齿痛消炎灵颗粒有效成分与靶点

共筛选到防风化学成分22 个、牡丹皮化学成分7 个、青皮化学成分7 个、荆芥化学成分12 个、白芷化学成分20 个、青黛化学成分9 个、地黄化学成分9 个、甘草化学成分88 个、细辛化学成分9个，去重后共得到化学成分264 个，见表1（由于甘草成分较多，展示OB、DL 值较高的成分）。将中药、活性成分、靶点关系导入至Cytoscape 3.9.1后得网络图，如图1 所示，共包含667 个节点，2 759 条边，每个中药活性成分的平均靶点数目为10.45 个。利用网络分析仪Network Analyzer 计算网络拓扑参数，化合物的平均degree 值为14.6，作用靶点较多的化合物有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇、木犀草素等。

图1 中药–活性成分–靶点网络图Fig.1 Traditional Chinese medicine -active ingredients -target network diagram

表1 齿痛消炎灵颗粒活性成分Table 1 Active components of Chitong Xiaoyanling Granules

2.2 牙周炎相关靶点

以“periodontitis”为关键词，通过GeneCards、TTD、OMIM、DisGeNET、DrugBank 数据库进行检索，合并去除重复值后收集到牙周炎相关靶点1 581个。运用Venny 2.1.0 将潜在活性成分的作用靶点与牙周炎疾病靶点合并后取交集，见图2，最终获得157 个齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的潜在靶点。

图2 “药物–疾病”共有靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of the common target of “drugs -disease”

2.3 化合物–靶点–疾病网络

将齿痛消炎灵颗粒活性成分、157 个共有靶点等数据导入Cytoscape 3.9.1，构建化合物-靶点-疾病网络，见图3，共包含322 个节点，1 400 条边，不同活性成分对应不同作用靶点，体现齿痛消炎灵颗粒多成分、多靶点的特点。利用网络分析仪Network Analyzer 计算网络拓扑参数，其中degree值较大的化合物为槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素、川陈皮素、柚皮素、β-谷甾醇等，预测其为齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的较为重要活性成分，见表2。

图3 化合物–靶点–疾病网络图Fig.3 Network diagram of compound -target -disease

表2 齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的活性成分（前10 位）Table 2 Active components of Chitong Xiaoyanling Granules in treatment of periodontitis (top 10)

2.4 PPI 网络

将药物、疾病共有靶点录入STRING 平台构建PPI 网络，将上述结果以TSV 格式下载并保存，导入Cytoscape 3.9.1，构建PPI 网络模型，结果如图4所示。该网络共含有靶蛋白节点155 个，靶点蛋白间的相互作用关系连线3 163 条，平均degree 值40.8，选取degree 值、BC、CC 均大于中位数的节点作为核心靶点，包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、蛋白激酶B1（Akt1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生长因子受体（EGFR）、低氧诱导因子-1（HIF-1A）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）等33 个核心靶点，见表3。

图4 靶点PPI 网络Fig.4 Network of PPI

表3 核心靶点及其拓扑学参数Table 3 Topological parameters of core targets

2.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集

将药物、疾病共同靶点导入Metascape 平台，进行GO 生物功能分析和KEGG 通路富集分析，以P＜0.01 为筛选标准，获得GO 生物功能条目2 137条，其中生物过程（BP）1 884 条，主要涉及对无机物的反应（response to inorganic substance）、细胞对化学胁迫的反应（cellular response to chemical stress）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）、对活性氧物种的反应（response to reactive oxygen species）、细胞对氧化应激的反应（cellular response to oxidative stress）等；细胞组分（CC）93条，主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain ）、质膜筏（plasma membrane raft）、局部黏连（focal adhesion）、细胞-基质结（cell-substrate junction）等；分子功能（MF）160 条，主要涉及DNA 结合转录因子结合（DNAbinding transcription factor binding）、RNA 聚合酶II特异性DNA 结合转录因子结合、核受体结合（nuclear receptor binding）、染色质结合（chromatin binding）、核雌激素受体结合（nuclear estrogen receptor binding）等，见图5。

图5 GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

KEGG 通路富集分析共获得206 个信号通路，主要涉及癌症信号通路（pathways in cancer）、脂质与动脉粥样硬化通路（lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（hepatitis B）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等，见图6。

图6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 “药物成分–靶点–通路”网络

应用Cytoscape 3.9.1 软件构建“药物成分-靶点-通路”网络图，如图7 所示，该网络共有255个节点，1 350 条边。网络拓扑学分析结果显示，槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚、柚皮素等为主要活性成分，见表4。主要靶点的网络拓扑学分析结果显示，degree 值最高靶点基因为PTGS2、雌激素受体α（ESR1）、雄激素受体（AR）、一氧化氮合酶2（NOS2）、糖原合酶激酶3B（GSK3B）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、雌激素受体2（ESR2）、视黄酸受体α（RXRA）等，见表5。

图7 “药物成分–靶点–通路”网络图Fig.7 “Drug composition -target -pathway” network diagram

表4 齿痛消炎灵颗粒活性成分网络拓扑学分析（degree 值前10 位）Table 4 Network topology analysis of main active components of Chitong Xiaoyanling Granules(top 10)

表5 靶点网络拓扑学分析结果（degree 度值前10 位）Table 5 Results of topological analysis of target network(top 10)

2.7 分子对接结果

将PPI 网络中degree 值排名前5 位的靶点与齿痛消炎灵颗粒中degree值靠前的活性成分进行分子对接，见表6。由表可见，分子对接结合能均＜-5 kJ/mol，对接结果具有较好的可靠性。选氢键数＞2的结合构象的相互作用进行可视化展示，见图8。

图8 分子对接结果Fig.8 Molecular docking result

表6 分子对接结合能Table 6 Molecular docking binding energy

3 讨论

本研究共筛选出齿痛消炎灵颗粒的264 个潜在成分、预测出457 个作用靶点，构建了“中药-活性成分-靶点”的网络，根据degree 值筛选出关键成分；构建“化合物-靶点-疾病”网络得出治疗牙周炎的关键成分和靶点多与炎症有关，揭示了齿痛消炎灵颗粒并不是通过单一成分、单一靶点治疗牙周炎，而是通过多成分、多靶点的作用方式；治疗牙周炎的潜在作用靶点富集得2 137 个GO 条目和206 条KEGG 通路中，包括与炎症、免疫系统、心血管系统等相关的条目和通路，如对氧化应激的反应、DNA 结合转录因子结合、局部粘连、脂质与动脉粥样硬化通路、乙型肝炎、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。通过“药物-靶点-通路”网络的构建并通过其内置工具分析齿痛消炎灵颗粒干预牙周炎靶点网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点，再次体现了齿痛消炎灵颗粒含的多种成分，可能通过多靶点干预牙周炎。最后，经过分子对接证实了部分关键成分，可以很好地与部分关键靶点相结合。

经分析得关键成分为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素。其中槲皮素是一种不含碳水化合物的类黄酮，是蔬菜和水果中含量最丰富的类黄酮，具有抗炎、抗菌、抗氧化、镇痛的作用[22]，Cheng 等[23]通过评估槲皮素对大鼠实验性牙周破坏的作用，证明槲皮素可以减少脂多糖（LPS）诱导的破骨细胞形成以及结扎增强的牙周炎症和骨质流失，得出结论槲皮素可能对牙周破坏具有改善作用。山柰酚是一种存在于多种植物中的天然黄酮类化合物，具有广泛的治疗特性，如抗氧化、抗癌和抗炎。它的作用机制是诱导细胞凋亡、降低细胞活力、下调磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 和人类T 细胞白血病/淋巴瘤病毒-I 信号通路，抑制上皮间质转化（EMT）相关标志物的蛋白质表达[24]。β-谷甾醇具有抗肿瘤、解热、免疫调节、抗炎、止痛、抗溃疡等作用[25]；Valerio 等[26]证实β-谷甾醇通过增强巨噬细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）的活性进而减弱核因子-κB（NF-κB）和信号传导及转录激活蛋白1（STAT1）通路的活性，发挥抗炎作用；Choi等[27]证实β-谷甾醇通过减少NO 的生成，抑制巨噬细胞IL-6 活性，减少TNF-α、IL-1β 等炎性因子的分泌，产生抗炎作用；Liz 等[28]证实，β-谷甾醇通过促进细胞钙的摄取，抑制髓过氧化物酶、腺苷脱氨酶的活性，抑制IL1β、TNF-α 的水平，发挥抗炎作用。柚皮素具有抗氧化、抗炎、生物利用度高、毒性小等特点，是一种有效的抗伤害性和抗炎性药物，可用于疼痛管理治疗[29]。木犀草素具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗纤维化等广泛药理作用，可以降低多种促炎细胞因子、趋化因子的表达还可提高IL-10、IL-13 等抗炎因子表达，调节多种炎症信号通路缓解炎症反应[30]。

本研究通过构建PPI 网络并对其进行拓扑学分析，以degree 值、BC、CC 均大于中位数的节点作为核心靶点，推测TNF、IL-6、IL-1β、Akt1、TP53、VEGFA、CASP3、MAPK3、EGFR、HIF-1A、PTGS2等靶点在齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的生物过程中起关键作用。其中TNF 通过与IL-1β 和IL-6 协同诱导VEGF 产生而在血管生成中发挥作用[31]。TNF-α 主要是来自单核巨噬细胞，是重要的生物活性细胞因子，可加速自由基及兴奋性氨基酸合成，提高血管通透性，促进炎性渗出，从而加重炎症反应[30]。IL-6 主要由T 细胞、单核细胞及内皮细胞产生，对免疫调节网络、炎症介质网络有关键作用，可促进患者TNF、IL-1 等的分泌[32]，IL-6 细胞因子家族包括IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、制瘤素M（OSM）、白血病抑制因子（LIF）、睫状神经营养因子（CNTF）、心肌营养素1（CT-1）和心肌营养素样细胞因子1（CLCF1），在所有细胞因子家族中，它在引发与健康和疾病相关的反应方面表现出最高程度的功能多效性和冗余性，IL-6 细胞因子家族的成员在健康和疾病中发挥着不可或缺的作用，它们通过调节各种代谢过程来影响免疫平衡和福祉的维持。在炎症期间，IL-6 家族细胞因子通过直接作用于先天免疫细胞和间接通过激活驻留在炎症部位的间质组织细胞来调节先天免疫[33]。IL-1β 是有效的促炎因子[34]，可以促进T 细胞的Th17 分化，与IL-12 协同作用，诱导辅助性T 细胞1（Th1）合成IFNG[34]，通过与TNF 和IL-6 协同诱导VEGF 产生而在血管生成中发挥作用[33]。

共同靶点富集分析结果表明齿痛消炎灵颗粒在治疗牙周炎的过程中，基因表达对无机物的反应、细胞对化学胁迫的反应、细胞对氧化应激的反应、膜筏、局部黏连、核受体结合等具有特异性。齿痛消炎灵颗粒治疗牙周炎的大多数潜在靶点与癌症通路、乙型肝炎、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等密切相关。推测齿痛消炎灵颗粒不仅能够治疗牙周炎等一些炎症疾病，还可以干预癌症、肿瘤等疾病。

综上所述，本研究应用网络药理学与分子对接的方法，对齿痛消炎灵颗粒的多成分、多靶点与牙周炎靶点之间的复杂网络关系进行全方位分析，推测齿痛消炎灵颗粒中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、木犀草素为主要活性成分，可能通过TNF、IL-6、IL-1β、Akt1、TP53、VEGFA、CASP3、MAPK3、EGFR、HIF-1A、PTGS2 等关键靶点作用于癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、乙型肝炎等主要信号通路来干预牙周炎疾病。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突