基于网络药理学和分子对接探讨厚朴排气合剂治疗慢性便秘潜在作用机制

张成盈，姜璐，王永森，张云松

1.山东中医药大学 第一临床医学院，山东 济南 250014

2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014

慢性便秘是一种以排便困难、排便次数减少及排便时间延长且迁延不愈达半年以上为主症的疾病[1]。随着经济水平的发展及人口老龄化时代的到来，人们饮食结构逐渐丰富的同时却忽略了对胃肠道疾病的重视，使慢性便秘这一全球广泛性疾病的新发率及患病率逐年上升，且大多数患者对疾病认知不足、滥用药物及过度就医，造成了疾病的慢性迁延，使其生活质量无法得到保证[2]。目前临床对慢性便秘的治疗药物常以西药为主，其有效性及安全性已得到证实[3]，然而因其病程较长，需长期辅助用药，但用药后药物依赖，水电解质紊乱等不良事件在临床诊疗中时常发生，甚至因肠神经系统损伤而引起结肠黑变病[1]，因此尚缺乏理想的治疗方法与手段。厚朴排气合剂作为中成药，其承仲景名方“厚朴三物汤”之义，由厚朴（姜制）、大黄、木香、枳实（麸炒）组成，立意行气消胀、宽中除满。临床诊疗中，常用于外科手术后肠道功能的恢复，此外，文献研究发现，近年来厚朴排气合剂在慢性便秘治疗中的使用率逐步上升，并显示出一定的临床疗效，但其潜在作用机制尚未明确。故本研究通过收集、筛选厚朴排气合剂的所有活性成分，进而运用网络药理学及分子对接的方法，将其治疗慢性便秘的潜在活性成分、靶点、通路进行可视化，明确其作用机制。

1 资料与方法

1.1 厚朴排气合剂活性成分及靶蛋白筛选

将厚朴、大黄、木香、枳实4 味中药输入TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中对其化学成分进行检索，依据口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18 的标准确定活性成分，同时查阅《中国药典》2020 年版[4]及相关文献将4味药中含量较大或活性强的化合物进行手动添加，最后将所有活性成分导入Uniport 数据库（https://www.uniprot.org/）寻找对应的靶蛋白。

1.2 药物–活性成分–靶点网络图构建及主要活性成分筛选

建立Network及Type 属性文件，导入Cytoscape 3.7.1 软件（https://cytoscape.org/）构建厚朴排气合剂-活性成分-靶点网络图并对提取活性成分。

1.3 慢性便秘靶点筛选及韦恩图绘制

将 “ chronic constipation ”“ functional constipation”作为关键索引词，在OMIM 数据库（https://omim.org/）、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、TTD 数据库（https://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com/）中进行信息检索，获得慢性便秘相关靶点，整合数据库所有相关靶点，删除重复值，建立慢性便秘疾病靶点数据库。在Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中将1.1 项下获取靶点与便秘疾病靶点取交集，绘制韦恩图，获得厚朴排气合剂治疗慢性便秘疾病的潜在作用靶点。

1.4 蛋白质相互作用网络构建（PPI）及可视化分析

利用String 数据库（https://cn.string-db.org/），将1.3 项下潜在作用靶点导入列表，以置信度≥0.4得到PPI 网络构建图，下载tsv 文件，在Cytoscape 3.7.1 中利用CytoNCA 插件，计算度中心性（DC）、介度中心性（BC）、紧密度中心性（CC）根据以上3 者的值对PPI 网络图进行可视化分析，最终得出厚朴排气合剂治疗慢性便秘关键靶点。

1.5 基因本体（GO）功能及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集通路分析

将厚朴排气合剂治疗慢性便秘潜在作用靶点输入Metascape 数据库（https://metascape.org/），以P＜0.05 为筛选条件，根据GO 及KEGG 分别进行个性化分析，通过微生信（http://www.Bioin formatics.com.cn/）对数据进行直观化体现。

1.6 分子对接

首先依据TCMSP 数据库获取关键活性成分的InChIKey，在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找化合物2D 结构，导入Chem3D 软件中进行结构优化，输出mol2 格式。检索PPI 网络中关键靶点在PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中的ID 并下载其晶体结构，通过PyMOL软件“remove solvent”“remove organic”指令去水分子及残基结构，导出pdb 格式，其后在Autodock软件中对大分子蛋白进行加氢及寻找活性口袋，对小分子配体导出pdbqt 格式，通过vina 进行对接分析，在PyMOL 软件中将分子对接进行可视化展示。根据结果进行对接分析，结合能为负值则说明配体可自发的与受体进行结合，当结合能小于-6 kJ/mol则说明结合较好。

2 结果

2.1 厚朴排气合剂活性成分及靶点

共获得56 种活性成分，其中大黄16 种，木香6 种，厚朴2 种，枳实22 种，通过文献检索[5-8]及中国药典[4]补充10 种，其中木香补充2 种，分别为木香烃内酯、异中美菊素C；厚朴补充6 种，分别为亚油酸甲酯、甲基反亚油酸甲酯、厚朴酚、和厚朴酚、10,13-十八二烯酸甲酯、和厚朴新酚；枳实补充2 种，分别为橙皮素、柚皮苷，见表1。药物成分靶点去重后共获得304 个相关靶点。

表1 厚朴排气合剂成分Table 1 Composition of Houpo Paiqi Mixture

2.2 药物–活性成分–靶点网络图

网络图中共355 个节点，840 条边，通过Network Analysis 插件计算degree 值，排名前10 位的活性成分为黄柏酮、木犀草素、大黄酸、β-谷甾醇、柚皮素、枸橘苷、木香烃内酯、和厚朴酚、豆甾醇、川陈皮素，这些成分可能为厚朴排气合剂治疗慢性便秘的主要活性成分，见图1。

图1 厚朴排气合剂–活性成分–靶点网络图Fig.1 Network of Houpo Paiqi Mixture -active ingredient -target

2.3 慢性便秘靶点

检索4 个数据库合并去重后共获得5 367 个慢性便秘相关靶点。通过Venny 2.1.0 取得厚朴排气合剂及慢性便秘交集靶点216 个，为厚朴排气合剂治疗慢性便秘的潜在靶点，见图2。

图2 厚朴排气合剂治疗慢性便秘的共同靶点Fig.2 Common targets of Houpo Paiqi Mixture in treating chronic constipation

2.4 PPI 网络

厚朴排气合剂治疗慢性便秘的PPI 网络（图3A）导入Cytoscape 3.7.1 进行可视化（图3B）。共有217 个节点，3 445 条边。利用CytoNCA 插件计算BC、CC、DC，依据degree 值得出前10 位关键靶点，包括蛋白激酶B1（Akt1）、肿瘤蛋白p53（TP53）、白细胞介素-6（IL-6）、半胱氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、转录因子AP-1（JUN）、白细胞介素-1B（IL-1B）、MYC、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原激活的蛋白激酶3（MAPK3），见表2。

图3 PPI 网络（A）及靶点可视化图（B）Fig.3 PPI network (A) and target visualization (B)

表2 厚朴排气合剂治疗慢性便秘关键靶点及拓扑参数Table 2 Key targets and topological parameters of Houpo Paiqi Mixture in treating chronic constipation

2.5 GO 功能及KEGG 富集通路分析

通过Metascape 数据库对217 个潜在靶点进行GO 分析（图4），按照P＜0.05 进行筛选，结果显示生物过程（BP）有5 880 条富集结果，涉及对激素、氮化合物、异生刺激、无机物、多肽、脂质等反应；分子功能（MF）分析共得到1 083 条富集显著结果；细胞组成（CC）有540 条富集结果，涉及树突、突触前、膜筏、膜微域、神经元细胞体等。

图4 GO 功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

通过上述数据库进行分析，获得286 条通路，前20 条通路可视化见图5。图中靶点通路主要涉及癌症相关通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信号通路、细胞衰老、巨细胞病毒感染、结直肠癌等。

图5 KEGG 富集通路分析Fig.5 KEGG functional enrichment analysis

2.6 分子对接

选择厚朴排气合剂中degree 值排名前3 位的活性成分黄柏酮、木犀草素、大黄酸与关键靶点Akt1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA 进行分子对接，对接参数见表3。一般认为，结合受体能为负值时认为体系更加稳定，以结合能＜-5 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）为筛选标准[9]，结合能＜-7 kcal/mol 结合活性较好，＜-8 kcal/mol 则结合活性较强[10]。对接结果显示，获得的对接结合能大部分＜-7 kcal/mol，均有较好的结合活性，其中大黄酸与CASP3（-8.3 kcal/mol）、TP53（-8.0 kcal/mol）对接最紧密，选择结合能力排名前6 位的组合进行可视化，见图6。

图6 有效活性成分与关键靶点对接模式图Fig.6 Model diagram of docking between active ingredients and key targets

表3 关键靶点与有效活性成分对接参数及结合能分数Table 3 Docking parameters and binding energy fraction of key targets and active ingredients

3 讨论

由于现代医学在治疗慢性便秘上存在一定程度的局限性，越来越多的学者将治疗慢性便秘的目光聚焦于中医药的发展。多项研究也证实了中药（包括中药汤剂及中成药）在治疗慢性便秘中发挥了显著的疗效[11-13]。通过对厚朴排气合剂中大黄、厚朴（姜制）、木香、枳实（麸炒）4 味药物进行研究，可获得治疗慢性便秘的主要成分，根据degree值排序的前5 位分别为黄柏酮、木犀草素、大黄酸、β-谷甾醇、柚皮素。上述有效成分可对应多个靶点，同一靶点也可对应多个有效成分，符合中药复方制剂多有效成分及多作用靶点的治疗特点。黄柏酮为黄柏中的柠檬苦素类成分[14]，可以兴奋肠道平滑肌，促进肠道收缩，改善结肠动力问题。研究表明，慢性便秘患者菌群结构较正常人有所不同，在门水平上，其粪便中拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度上升，变形菌门（Proteobacteria）相对丰度下降[15]，Luo 等[16]发现黄柏酮治疗后可使小鼠拟杆菌门相对丰度下降，变形菌门相对丰度上升，逆转了肠道菌群的失衡。木犀草素为黄酮类化合物，其对慢性便秘的治疗机制主要体现于平滑肌运动的调控，木犀草素可通过对Ca2＋通道的调控起到促进平滑肌运动的作用[17]；同时，木犀草素可使肌细胞的中Akt去磷酸化而减少活化，阻止PI3K/Akt 信号通路的激活，从而减少平滑肌细胞的增殖，避免平滑肌病理状况的发生发展[18]。此外一氧化氮（NO）作为内源性防御分子，高NO 可抑制消化道平滑肌的收缩功能，导致患者出现排便困难的症状[19]，而木犀草素恰恰在发挥抗炎作用时可降低NO 含量，抑制细胞因子表达，改善大便性状[20]，起到缓解便秘的作用。大黄酸作为大黄中游离蒽醌类成分，可有效减少肠道致病菌的产生，并能显著增加乳酸杆菌数量，调节肠道菌群的相对丰度和比例，保持肠道微生态的平衡[21-22]。β-谷甾醇具有抗抑郁、抗炎、抗氧化、抗菌等药理作用，可通过抑制细胞炎症因子（IL-1β、IL-8、TNF-α 等）的活性，降低TLR2、p-IκB-α、NFκB p65、IκK-α 蛋白表达水平，改善胃肠道黏膜损伤，从而减轻便秘的症状[23-24]。柚皮素与木犀草素相同，均属于具有抗炎、抗氧化和抗癌作用的黄酮类化合物，同样也具有抑制肠道内炎症因子及蛋白过量表达的作用，减轻肠黏膜损伤，起到治疗便秘的作用。

根据PPI 网络分析，发现Akt1、TP53、IL-6、CASP3、IL-1B、MAPK3 等为厚朴排气合剂治疗慢性便秘的关键核心靶点。Akt1 属于Akt 家族中的1种亚型，参与细胞的增殖、生长、凋亡整个过程，在多个肿瘤通路中起到关键作用，然而肿瘤通路对Cajal 间质细胞表达有一定抑制，从而导致胃肠收缩动力减弱[25-27]。研究表明，Akt 被PI3K/Akt 通路激活后，肠道内Akt 磷酸水平显著上调，提示PI3K/Akt通路的激活促进平滑肌的增殖，参与了便秘的发生过程[28]。TP53 是一种抑癌基因，负责调控细胞生长、增殖及损伤修复，当细胞DNA 受损严重时，TP53 蛋白则阻止细胞修复，诱导细胞凋亡，同时TP53 蛋白通过与PPP1R13B/ASPP1 或TP53BP2/ASPP2[29]的相互作用可增强其凋亡活性。CASP 在细胞凋亡信号传导的级联反应中协同作用，参与细胞的生长、分化、增殖和运动，于细胞凋亡最密切相关，CASP3 是细胞凋亡的效应者，参与细胞凋亡的执行。IL-1β 和IL-6 作为多效性促炎细胞因子，可调节细胞生长，以及细胞活化、增殖、存活和分化。IL-1β 较IL-6 有更广泛的促炎性，可参与IL-6的调节过程，范文涛等[30]发现通过抑制IL-6 的释放，IL-6/JAK/STAT3 信号通路呈现下调趋势，抑制胃肠道炎症反应，实验组大鼠的肠道局部微环境可以得到改善。研究显示，便秘大鼠结肠内MAPK 表达水平明显低于对照组[31]，万叶敏等[32]进一步发现大鼠结肠组织内水通道蛋白AQP3、AQP4 的表达量受MAPK 通路的下调，肠道对水分的重吸收减弱，大便性状发生变化，从而便秘得到缓解。

GO 富集分析结果显示，厚朴排气合剂可能通过激素反应、氮化合物反应、异生刺激反应等增加大便次数，使粪质变软，从而改善便秘的不适。KEGG 富集分析结果显示，厚朴排气合剂治疗慢性便秘的主要通路有PI3K/Akt 信号通路、癌症相关通路、细胞衰老等。有研究已证实衰老的大鼠具有明显的便秘行为，便秘的大鼠也出现明显的衰老状态，这一变化与癌症通路直接相关[33]。随着我国老龄化社会的发展，老年人慢性便秘疾病的问题越来越严峻，通过细胞衰老这一思路或可为防治慢性便秘提供一条新的探索道路。分子对接结果显示，厚朴排气合剂主要活性成分（黄柏酮、木犀草素、大黄酸）与核心靶点（Akt1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA）具有良好的对接活性，证实了以上网络药理学预测结论的可靠性，其中大黄酸与CASP3、TP53、IL-6 结合较紧密，木犀草素与CASP3、IL-6结合较紧密，黄柏酮与CASP3 结合较紧密，进一步表明这些成分及靶点与厚朴排气合剂治疗慢性便秘密切相关，为后期进行分子细胞学实验提供重要的研究方向。

综上所述，通过网络药理学与对子对接结合的方式，验证了厚朴排气合剂治疗慢性便秘多途径、多靶点、多通路的机制，总结出厚朴排气合剂可能通过作用于Akt1、TP53、IL-6、CASP3、IL-1B、MAPK3 等多个靶点，调节PI3K/Akt 信号通路、细胞衰老通路、癌症相关通路、巨细胞病毒感染通路等多条通路，通过抑制炎症反应、抗衰老、调节平滑肌运动等方式治疗慢性便秘疾病。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突