山羊源加勒多尼亚链球菌(Streptococcus caledonicus)的分离鉴定及耐药性分析

李富祥,喻永福,朱 沛,杨仕标,赵文华,宋建领,高华峰*

(1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室,云南 昆明 650224;2.石林彝族自治县动物疾病预防控制中心,云南 石林 652200)

加勒多尼亚链球菌(Streptococcuscaledonicus)是2020年英国FOSTER等[1]分类命名的链球菌属的一个新种。到目前为止,链球菌属包括100多个细菌种,其中,绝大部分细菌种是人和动物重要的致病菌或条件致病菌[2-13]。到目前为止,S.caledonicus的分离鉴定的报道罕见,仅见英国从发病绵羊肺脓肿、胸腔积液、脑和胎儿样品中分离到该细菌的报道[1],未见其他国家关于该细菌的研究报道。

2022年7月,云南石林县某山羊养殖户的奶山羊发生皮下脓肿,皮下脓肿主要发生在颈部、胸部和腹部,发病率为14.3%(8/56),严重影响羊只的生长和销售,大大降低了养羊业的经济效益。为明确病原,无菌采集2只羊的脓液进行细菌学诊断,从2只羊的脓液样品中各分离到1株革兰阳性链状球菌,编号分别为YN220769和YN220770。并对2株分离株进行形态学、生理生化和16S rDNA基因鉴定,并分析2株分离菌的致病性和药物敏感性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验动物哥伦比亚琼脂和革兰染色试剂盒购自杭州滨和微生物试剂有限公司;细菌基因组提取试剂盒、2×HotStart Taq PCR MasterMix和DL2000 DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司;Rapid ID32 STREP链球菌快速生理生化鉴定试验条购自法国BioMerieux公司;青霉素、卡那霉素、头孢噻吩等17种药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;氟苯尼考药敏纸片购自英国OXOID公司。体质量为18～22 g的昆明小鼠购自昆明医科大学实验动物学部。

1.2 引物设计细菌16S rDNA基因通用引物27F/1492R按照STACKEBRANDT等[13]报道的引物序列进行设计。

1.3 细菌分离将脓液样品划线接种哥伦比亚琼脂平板,于37℃、5% CO2条件下培养48 h,挑选单菌落进行纯培养获得细菌分离株并将其编号。用细菌革兰染色试剂盒将分离株进行染色镜检,观察菌体形态。CO2生长需要试验:将分离株接种哥伦比亚琼脂平板,分别在普通空气和37℃、5% CO2条件下培养72 h,观察分离株生长特性。

1.4 生理生化鉴定利用Rapid ID32 STREP链球菌快速生理生化鉴定试剂条对分离株进行生理生化鉴定,过氧化氢酶试验方法:挑取菌落至载玻片上,在菌泥上滴加3.0%过氧化氢溶液,有气泡产生则为过氧化氢酶阳性,无气泡产生为过氧化氢酶阴性。

1.5 16S rDNA基因测序利用细菌基因组提取试剂盒分别提取各分离株的基因组DNA作为PCR模板,采用引物27F /1492R PCR扩增16S rDNA基因,PCR反应条件参照文献[13]报道的反应条件进行,利用1.2%琼脂糖凝胶电泳方法对PCR扩增产物进行鉴定,鉴定正确的扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序所得基因序列提交GenBank数据库获得基因登录号。

1.6 16S rDNA基因同源性及遗传进化分析将分离株16S rDNA基因在GenBank数据中进行BLAST比对(Blastn方法),下载同源性较高的16S rDNA基因序列以及链球菌属部分模式菌株的16S rDNA基因序列,利用MegAlign软件(Clustal W 方法)对分离株进行同源性分析。利用MEGA 4.0.2软件构建系统进化树(Neighbor-Joining进化树),分析分离株与参考株16S rDNA基因的遗传进化关系。在进化树构建中,bootstrap values设定为1 000,选择枯草芽孢杆菌模式菌株ATCC 6051T(ABQL01000001) 作为进化树的外群。

1.7 致病性试验将分离株接种营养肉汤,于37℃、5% CO2条件下培养48 h,5 000 r/min离心10 min,弃上清,用灭菌生理盐水将菌泥重悬,用平板计数法测定菌悬液浓度,用灭菌生理盐水将菌悬液浓度调整为1.2×107CFU/mL用于致病性试验。每株分离株接种5只小鼠作为1个试验组,每只小鼠股内侧皮下接种菌悬液50 μL(即每只小鼠接种剂量为6.0×105CFU);对照组的5只小鼠股内侧皮下接种灭菌生理盐水50 μL;接种后的小鼠继续饲养20 d,观察临床症状;第20天将小鼠剖检观察病理变化,分析分离株对小鼠的致病性。

1.8 药敏试验参照 CLSI2013 推荐的纸片扩散法对分离株进行药敏试验,结果以敏感、中介和耐药进行判定,分析分离株对18种抗菌药物的敏感性。

2 结果

2.1 细菌分离及生长特性分析2只羊脓液病料样品接种营养琼脂,培养24 h无可见菌落,培养48 h均长出大量纯粹半透明小菌落,菌落直径为0.5～1.0 mm。挑取单菌落进行纯培养,从2只羊脓液病料样品各分离到1株细菌,编号依次为YN220769和YN220770。2分离株在含5% CO2条件下生长良好,在普通空气培养条件下不生长。2株分离菌均为革兰阳性小杆菌,菌体直接约为0.5 μm,菌体成双或成链状排列,其中分离株YN220769的革兰染色形态见图1。2株分离菌的菌落和菌体形态以及生长特性与报道的S.caledonicus相符[1]。

图1 分离株YN220770的革兰染色形态

2.2 生理生化鉴定2株分离菌YN220769和YN220770生理生化特征相同,均表现为:产生β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酰基-苯氨酰基-脯氨酸-奈酚胺酶和N-乙酰葡萄糖胺酶;不产生精氨酸双水解酶、α-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、焦谷氨酸芳酰胺酶、甘氨酰-色氨酸酶-奈酚胺酶、β-甘露糖酶、尿素酶和过氧化氢酶;分解D-乳糖、D-海藻糖、D-麦芽糖、甲基-B-D-吡喃葡萄糖苷和芽霉菌糖产酸;不分解D-核糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-蔗糖、D-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、α-环糊精、糖原和D-塔格糖产酸;马尿酸盐试验阳性。2株分离株的绝大部分生理生化特征与报道的5株S.caledonicus分离株相同[1],仅少部分生化特征与报道的5株S.caledonicus分离株存在差异,其中马尿酸盐水解试验阳性和不分解糖原产酸与报道的5株S.caledonicus分离株均不同,分解D-棉子糖、D-蜜二糖和D-松三糖产酸与报道的S.caledonicus部分分离株相同(表1),将2分离株初步鉴定为S.caledonicus。

表1 2株分离菌与5株英国分离菌不同的生化特征

2.3 16S rDNA基因序同源性分析将2株分离菌YN220769和YN220770的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库,得到基因登录号分别为OP199089和OP199090。16S rDNA基因序列同源性分析结果显示,2株分离菌之间的同源性为99.8%,分离株YN220769和YN220770与S.caledonicus模式菌株CCUG 73951T的同源性分别为99.7%和99.9%,2株分离菌与其他S.caledonicus参考株间的同源性为99.6%～100.0%,将2株分离菌进一步鉴定为S.caledonicus。

2.4 16S rDNA基因遗传进化分析16S rDNA基因Neighbor-Joining遗传进化树显示,2株分离菌YN220769和YN220770与S.caledonicus模式菌株CCUG 73951T以及其他S.caledonicus参考株形成同一个进化分支,其支持率高达100.0%(图2),将2株分离菌最终鉴定为S.caledonicus。

2.5 致病性试验2个试验组全部小鼠均在接种菌液4 h后陆续出现精神稍差、活动减少;接种后12 h全部小鼠精神和活动恢复正常;接种后3～5 d全部小鼠接种部位均出现皮肤溃疡;接种后20 d内均未出现脓肿。对照组小鼠接种灭菌生理盐水后未出现临床症状,剖检也未出现病理变化。表明2株分离菌YN21118和YN22011对小鼠具有较强的致病性。

2.6 药敏试验药敏试验结果显示,2株分离菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢噻吩、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克洛、头孢曲松、链霉素、卡那霉素、红霉素、阿米卡星、四环素、氧氟沙星和氟苯尼考敏感,对磺胺甲恶唑耐药。YN220769对庆大霉素敏感,YN220770对庆大霉素中介。

图2 链球菌属细菌16S rDNA基因序列Neighbor-Joining遗传进化树

3 讨论

Streptococcuscaledonicus是2020年英国FOSTER等[1]分类命名的链球菌属的一个新种,其命名是根据其模式菌株CCUG 73951T和其他分离株的来源地Caledonia而命名,因此,我们建议将Streptococcuscaledonicus译名为加勒多尼亚链球菌。目前,国内外仅见FOSTER等[1]从绵羊中分离S.caledonicus的报道,本研究首次在山羊皮下脓肿的脓汁病料中分离到S.caledonicus,证实了山羊S.caledonicus感染的存在;并首次报道其致病性和耐药性,为山羊S.caledonicus感染的预防和控制研究提供基础数据和菌株资源。

在细菌生物学特性分析试验中,2株分离菌YN21118和YN22011在含5% CO2条件下培养48 h 生长良好,但在普通空气培养条件下培养72 h不生长,与FOSTER等[1]报道绵羊源分离株生长特性一致,本研究进一步证实S.caledonicus是一种典型的嗜CO2细菌,为S.caledonicus的分离鉴定提供参考方法。本研究首次对S.caledonicus的耐药性进行分析,结果表明2株中国分离菌的耐药性存在差异,分离株YN220769对庆大霉素敏感,而分离株YN220770对庆大霉素中介。2株分离菌YN21118和YN22011仅对磺胺甲恶唑耐药,对16种抗菌药物均敏感,其中青霉素和头孢类抗菌药物敏感性最高,可作为我国S.caledonicus感染治疗的首选药物。

本研究首次对S.caledonicus的致病性进行分析,结果表明,2株分离菌皮下接种6.0×105CFU能使100.0%接种小鼠发生皮肤溃疡病理变化,表明其对小鼠具有较强的致病性;将每只小鼠接种剂量由6.0×105CFU增加到6.0×106CFU,仍然只能使100.0%接种小鼠发生皮肤溃疡病理变化,不能使小鼠发生皮下脓肿病理变化,可能原因为小鼠不是S.caledonicus性皮下脓肿的敏感动物。由于本研究从山羊脓肿中仅分离到S.caledonicus,未分离到其他细菌;此外,FOSTER等[1]也报道了从绵羊肺脓肿中分离到S.caledonicus的报道;因此,我们推测S.caledonicus可能是山羊皮下脓肿的一种潜在新条件致病菌,该推测有待进一步用山羊致病性试验加以证实。