4-萜烯醇对沙门菌的抗菌机制

连凯琪,孟 蕊,王梦婷,张向丽,王国栋,张明亮,张坤朋*,周玲玲*

(1.安阳工学院 河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室/河南省药用植物综合利用工程技术研究中心/博士后创新基地,河南 安阳 455000;2.河南农业大学 动物医学院,河南 郑州 450046)

沙门菌的危害主要表现在能导致人和动物感染伤寒、副伤寒和胃肠炎等疾病,还可以引起食物中毒,严重危害公共健康安全[1]。随着养殖业的发展,动物源性细菌耐药性可通过食物链传播最终对人类的健康产生严重影响[2]。目前临床治疗有四环素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类等多种抗菌药物,养殖业普遍采用β-内酰胺类抗菌药物进行治疗[3]。但由于长期不合理使用或滥用抗生素类药物,使沙门菌的耐药问题每况愈下[4-5]。为避免耐药性的提高,寻找抗生素替代品或协同药物成为当前亟待解决的问题[6-7]。

前期研究发现,4-萜烯醇对革兰阳性菌中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有良好的抗菌活性[8]。本试验选择沙门菌作为代表菌株,研究4-萜烯醇对革兰阴性菌的抗菌作用。通过对4-萜烯醇处理过的沙门菌的形态进行观察,同时对沙门菌胞内ATP、碱性磷酸酶等内容物泄露情况检测,证明4-萜烯醇对沙门菌具有良好的体外抗菌效果,可以破坏沙门菌的细胞膜,增大其通透性。本研究为进一步深入探索4-萜烯醇的抗菌机制提供了思路。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂沙门菌ATCC 13076(血清型:O1,9,12:Hg,m:-)由河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室保存。浓度≥95%的4-萜烯醇溶液(货号W224847)购自Sigma-Aldrich;DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒与三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒购自Beytime;电镜固定液购自武汉谷歌生物科技有限公司;细菌DNA提取试剂盒、胰蛋白胨、酵母浸出物、肉汤培养基均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 4-萜烯醇对沙门菌最小抑菌浓度(MIC)测定取100 μL 过夜培养的沙门菌,用灭菌的 PBS缓冲液稀释至2×105CFU/mL。在超净工作台中取出4排96孔细胞培养板,第1行每孔加入50 μL氨苄霉素作为阳性对照;第2行每孔加入50 μL灭菌PBS作为阴性对照;第3,4行的第1孔加入4-萜烯醇,终浓度为0.128 mol/L,然后倍比稀释至第8孔。各孔再加入50 μL稀释好的菌液,封口后置37℃培养16 h。每孔加入10 μL刃天青溶液,再次用封口膜覆盖,37℃恒温培养30～60 min,期间观察颜色变化。有细菌生长时刃天青溶液由蓝紫色变为粉红色,最后1个蓝紫色孔的4-萜烯醇浓度即为其对沙门菌的MIC。

1.3 4-萜烯醇对沙门菌时间抑菌曲线将培养至对数生长期的沙门菌按体积比1∶100转接至4个灭菌试管中,每管加入不同体积的4-萜烯醇溶液,使其终浓度分别为1,4,8 MIC,另一组加灭菌 PBS 作为阴性对照。将试管置于恒温摇床37℃、220 r/min培养,每隔2 h取1次样,取至12 h,然后继续培养至24 h再取样1次。每次取样后用封口膜覆盖并于4℃保存。用多功能酶标仪测量所取样品在600 nm 处的D值。

1.4 扫描电子显微镜观察将培养至对数生长期的菌液用灭菌PBS洗涤、重悬后分成2管。加入适当体积的4-萜烯醇溶液,使其终浓度为1 MIC,同时用灭菌PBS设置阴性对照。37℃水浴1 h,4 000 r/min离心5 min,弃上清液,无菌PBS洗涤2次。用电镜固定液重悬,室温条件下固定菌体2 h后,于4℃保存,送武汉赛维尔生物科技有限公司进行样品处理和观察。

1.5 核酸与蛋白质泄露检测将培养至对数生长期的菌液用灭菌PBS洗涤、重悬后分成4管。向重悬液中加入4-萜烯醇(终浓度分别为1,4,8 MIC),并用灭菌PBS设置阴性对照。于37℃水浴中孵育,每隔1 h取200 μL样品,4 000 r/min离心5 min,取上清液测定D260和D280的值。

1.6 ALP含量测定将培养好的菌液用灭菌PBS洗涤、重悬后分成5管。其中3管加入4-萜烯醇(终浓度分别为1,4,8 MIC),同时设置PBS作为阴性对照和0.3%的Triton X-100作为阳性对照。将样品37℃水浴1 h。12 000 r/min 离心5 min,分离上清于新离心管中用于后续测定。按照说明书要求配置标准品和显色底物,低温保存。取96孔板,第1列每孔加不同体积的标准品工作液和检测缓冲液,再加50 μL的显色底物用吸液枪吹打混匀。其余孔分别加入50 μL样品,再加入50 μL显色底物用吸液枪吹打混匀。用封口膜覆盖,放置在恒温培养箱,37℃孵育30 min。孵育结束后每孔加入100 μL反应终止液。用多功能酶标仪在405 nm处测定D值。

1.7 胞内ATP含量测定将培养好的菌液用灭菌PBS洗涤、重悬后分成4管,其中3管加入4-萜烯醇,使其终浓度分别为1,4,8 MIC,同时用PBS设置阴性对照。于37℃水浴1 h。4℃离心弃上清,加200 μL裂解液,低温静置裂解。4℃离心后转移100 μL上清,低温保存备用。按说明书制备标准品,按要求操作消耗ATP背景值,防止其对结果产生影响。第1列分别加入20 μL不同浓度的标准品,其余孔分别加入20 μL处理好的样品。静置20 s后用多功能酶标仪检测其D值。

1.8 4-萜烯醇对沙门菌DNA的影响将培养至对数生长期的菌液按照细菌DNA提取试剂盒说明提取DNA,并用紫外分光光度计检测DNA的浓度。取6个100 μL无菌离心管,每管加入0.5 μg DNA,然后加入4-萜烯醇,使其与DNA的质量比分别为0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,每管总体积为20 μL。37℃水浴中30 min。将反应后的样品进行核酸凝胶电泳,并用凝胶成像仪观察结果。

1.9 统计学分析数据采用GraphPad Prism 6软件进行分析。*P<0.05 表示差异显著,**P<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 4-萜烯醇对沙门菌最小抑菌浓度通过刃天青指示剂检测4-萜烯醇对沙门菌的MIC,结果显示,两处理组均在第5孔出现了颜色变化,则第4孔的浓度为4-萜烯醇对沙门菌的MIC,即0.016 mol/L(图1)。

图1 4-萜烯醇对沙门菌的MIC

2.2 4-萜烯醇对沙门菌的抑菌曲线为了研究4-萜烯醇对沙门菌的具体抑制时间和抑制强度,测定了抑菌曲线。结果表明,与对照组相比, 1 MIC 4-萜烯醇处理组至少在24 h内可以完全抑制沙门菌的生长(图2),说明4-萜烯醇不仅可以很好的抑制沙门菌的生长繁殖,而且其结构较为稳定,不会轻易被沙门菌代谢物降解。

图2 4-萜烯醇对沙门菌的抑菌曲线

2.3 扫描电子显微镜观察结果由图3可知,与对照组菌体相比(图3A,B),经4-萜烯醇作用后的沙门菌菌体皱缩、菌体表面变得粗糙(图3C,D)。结果表明4-萜烯醇对沙门菌的菌体形态产生了影响。

2.4 核酸与蛋白质泄露检测如图4所示,经4-萜烯醇处理后,沙门菌的核酸和蛋白质发生明显的泄露,1 MIC处理组核酸、蛋白质的泄露量随着4-萜烯醇作用时间的延长而逐渐增多;4,8 MIC两个处理组则是在作用1 h就基本达到了最大泄露量。这说明低浓度4-萜烯醇的作用效果可以随着作用时间的延长而增强,且对沙门菌的作用效果呈剂量依赖性。

A,C.PBS处理组;B,D.4-萜烯醇处理组

图4 4-萜烯醇对沙门菌核酸(A)和蛋白质泄露(B)的影响

2.5 ALP含量测定结果如图5所示,1 MIC处理组的沙门菌ALP出现泄露,且其泄露程度与阴性对照组相比呈显著性差异,4,8 MIC以及阳性对照3个处理组ALP的泄露程度与阴性对照组相比呈极显著性差异。这说明4-萜烯醇可以破坏沙门菌的细胞壁,造成ALP泄露,且泄露程度与4-萜烯醇的浓度呈正相关。

2.6 ATP含量测定ATP 含量测定结果如图6所示,与对照组相比,1 MIC 4-萜烯醇处理组的沙门菌胞内ATP含量极显著降低,4,8 MIC 2个处理组相比于1 MIC处理组其ATP含量下降更加显著,说明沙门菌的能量机制损伤随4-萜烯醇浓度的增大而加重,两者呈正相关。

2.7 4-萜烯醇对沙门菌DNA的影响不同浓度4-萜烯醇与沙门菌DNA作用结果如图7所示,处理组DNA条带的亮度与对照组相比没有发生降解和拖带,这说明4-萜烯醇不具有降解沙门菌的DNA的作用,并且也不与沙门菌的DNA结合。

图5 4-萜烯醇对沙门菌的ALP泄露的影响

图6 4-萜烯醇对沙门菌胞内ATP含量的影响

M.DL2000 DNA Marker;1～6.4-萜烯醇和沙门菌的质量比分别为0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0

3 讨论

随着国家无抗绿色健康养殖政策的推广,开发天然产物抗菌药物越来越受到广泛关注[9-11]。4-萜烯醇作为多种植物提取物活性成分之一,是一种天然存在的单萜,微溶于水,溶于醇类和油类,因此在试验中常制成水乳剂使用。CORDEIRO等[12]表明,4-萜烯醇与金黄色葡萄球菌的PBP2a蛋白结合并抑制其活性,PBP2a蛋白的产生是金黄色葡萄球菌诱导-内酰胺广泛临床耐药性的主要机制。MERTAS等[13]研究表明,4-萜烯醇可增强氟康唑活性,降低其对白色念珠菌的MIC,将4-萜烯醇等天然物质与氟康唑等常规药物结合使用可能有助于治疗难治性酵母菌感染。MONDELLO等[14]证明4-萜烯醇在体内可以控制白色念珠菌阴道感染。纯化后的化合物有望用于治疗阴道念珠菌病,尤其是对氟康唑类耐药的念珠菌病。FERRINI等[15]表明4-萜烯醇对莫匹罗星、夫西地酸、万古霉素、甲氧西林和利奈唑胺的葡萄球菌耐药菌株均具有活性,这些表明4-萜烯醇具有良好的抗菌作用。本研究主要探索了4-萜烯醇对沙门菌的作用机制,最初通过刃天青试验评估了4-萜烯醇对沙门菌的MIC,继而从时间抑菌曲线结果看出1 MIC 4-萜烯醇可以在24 h内持续抑制沙门菌的生长与繁殖。扫描电子显微镜结果显示,经4-萜烯醇处理后的沙门菌的结构变化主要是菌体之间黏连、菌体皱缩。

ALP是一种位于细胞膜和细胞壁之间能将对应底物去磷酸化的酶,如果细胞壁遭受损伤,可以从上清液中检测ALP[16]。在本研究中,经4-萜烯醇处理的沙门菌上清液中ALP荧光信号随4-萜烯醇浓度的增加而增强,ALP含量变化可能是由于沙门菌细胞壁被破坏导致ALP泄露,并且泄露程度与4-萜烯醇的浓度呈正相关。核酸和蛋白质在1 MIC处理组时泄露量随着时间延长而逐渐增多,4,8 MIC 2个处理组则是在第1小时达到最大泄露量。两种物质的泄露趋势说明在高浓度4-萜烯醇处理下,可能在短时间内对沙门菌细胞结构形成严重损伤,导致核酸和蛋白质迅速外流,而低浓度的4-萜烯醇则会随着时间的延长逐步破坏沙门菌的细胞结构。ATP 作为细胞内重要的能量物质,经常被用于评价细菌或细胞的能量代谢水平[17-18],其含量大幅度降低更说明沙门菌的正常生理功能遭受到了严重破坏[19]。4,8 MIC 2个处理组ATP含量极显著下降也与4,8 MIC 2个处理组核酸、蛋白质短时间内迅速泄露的结果相呼应。沙门菌胞内 ATP 含量下降有3种可能:沙门菌细胞结构完整性被破坏,导致胞内 ATP 泄露至上清液中;沙门菌细胞通透性增强,内容物泄露,导致能量合成机制被损伤,无法顺利合成ATP;沙门菌应激,导致ATP消耗量急剧上升,其合成量远远小于消耗量。至于ATP含量降低的真正原因还需要进一步研究。除了已检测出的ALP、核酸和蛋白质等物质的泄露外,还有可能导致其他物质泄露,如钙离子等电解质物质,继而导致膜电位出现异常[20]。同时沙门菌应激过程中是否会导致活性氧产生,启动细胞凋亡机制等还有待深入探索[21]。

本研究表明4-萜烯醇对沙门菌具有较强的抑菌活性,通过破坏沙门菌的细胞膜和细胞壁结构完整性,使胞内核酸、蛋白质、ALP等内容物发生不同程度的泄露,能量物质ATP含量无法维持正常,最终影响沙门菌的正常代谢,从而无法正常生长繁殖。本研究初步探索了4-萜烯醇对沙门菌的作用机制,为后续开发天然化合物作为抗菌药物以减缓更多耐药菌的出现提供了理论基础。