氮添加和刈割条件下羊草光合-CO2响应过程及模型比较研究

杨斯琪，鲍雅静，叶佳琦，2，吴帅，张萌，徐梦冉，赵钰，吕晓涛，韩兴国

（1. 大连民族大学环境与资源学院，辽宁 大连 116600；2. 内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古 呼和浩特 010021；3. 中国科学院沈阳应用生态研究所额尔古纳森林草原过渡带生态系统研究站，辽宁 沈阳 110016；4. 中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室，北京 100093；5. 中国科学院大学，北京 100049）

光合作用的强弱是决定植物干物质积累程度的基础[1］。CO2是光合作用的重要底物，是影响植物光合作用的主要限制因子，CO2浓度升高将有助于提高植物光合能力和生长发育[2-4］。CO2响应曲线能反映植物净光合速率随CO2浓度的变化趋势。通过测定CO2响应曲线，能得到CO2饱和点（CO2saturation point，Cisat）、最大净光合速率（maximum net photosynthetic rate，Pnmax）、CO2补 偿 点（CO2compensation point，Γ）、光 呼 吸 速 率（light respiration rate，Rp）和初始羧化效率（initial carboxylation efficiency，α）等重要光合参数[5-6］。目前已创建多种CO2响应曲线的拟合模型，其中最常用的有直角双曲线模型[7］、非直角双曲线模型[8］、直角双曲线修正模型[9］和Michaelis-Menten 模型等[10］。大量研究表明对同一植物进行拟合时，不同模型的效果存在差异[7，11-12］。因此在对植物进行曲线拟合及参数求解时，应进行比对分析以选取最佳模型。

氮（N）是植株生长所必需的三大营养元素之一，施氮水平是影响植物光合作用的重要因素[13-14］。适量施用氮肥可提高植物叶绿素相对含量、气孔导度和净光合速率，提高植物抗旱性，但过高或过低的施氮水平均会影响植物的光合特征[15］。研究表明，适量施氮能显著增加羊草的叶面积和叶绿素含量，提高叶片氮浓度和净光合速率并降低荧光特性，促进羊草生长[16-17］。但关于不同施氮浓度下，羊草的光合-CO2响应特性及模型适用性筛选仍然缺乏试验依据。

刈割是天然草地的重要管理措施[18］。刈割将地上的营养物质从生态系统中移出，改变草原生态系统的生物量分配模式和养分利用效率，影响植物的生长发育[19-20］。同时，已有研究表明适度的刈割次数和留茬高度能促进氮添加下植物的净光合速率、叶绿素含量和养分含量[21］。目前，关于刈割对羊草影响的研究相对较少，且大多集中在化学计量特征、养分分配策略和补偿生长等方面[22-24］，但关于氮添加和刈割下羊草光合特性随CO2浓度变化的响应规律仍未见报道。

中国的草原面积占国土面积的40%以上，在全球碳循环中扮演着重要角色[25］。内蒙古草原是中国北方典型的温带半干旱草原，也是欧亚草原的主要组成部分[26］。羊草（Leymus chinensis）是该区域的优势种之一。本研究在不同氮添加水平和刈割处理下，分别测定羊草光合作用的CO2响应曲线，采用直角双曲线模型、非直角双曲线模型、直角双曲线修正模型和Michaelis-Menten 模型进行拟合分析，筛选出氮添加和刈割下羊草的最适CO2响应拟合模型，并探讨羊草响应特性与氮添加和刈割的关系。研究结果将为确定最适的羊草CO2响应拟合模型提供理论依据，为科学指导内蒙古草原的管理措施制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本研究在中国科学院沈阳应用生态研究所额尔古纳森林草原过渡带生态系统定位研究站（50°10′ N， 119°22′ E）进行，海拔523 m。该地区年平均降水量为363 mm，年平均气温为-2.45 ℃。刈割是该地区传统的草地利用方式。加氮（NH4NO3）试验始于2014 年5 月底，采用随机完全区组设计。设置6 种氮添加水平（0、2、5、10、20和50 g N·m-2·a-1）与刈割（mowing， M）和非刈割（unmowing， A）两种草原管理方式交互处理，共12 个处理，每个处理重复8 次（共96 个处理区）。每个样方的面积为10 m×10 m，每年5 月下旬施用一次氮肥。将肥料与沙子混合，用手均匀撒播。为了避免潜在的混杂效应，所有样地都播撒相同数量的沙子（每块0.5 kg）。每年8 月下旬在离土壤表面10 cm 的高度进行刈割，以模拟收割干草。收获的生物量从样方中移除。

1.2 光合-CO2响应曲线测定

2021 年8 月中旬采用Li-6400 光合作用测定系统（Li-Cor Inc. ， Lincoln， NE， 美国），在晴朗无风天气的9：00-11：30，对每个处理随机选取长势良好的相同叶位的羊草叶片进行光合-CO2响应曲线测定。测定时气体流速设置为500 μmol·s-1，空气相对湿度控制在60%左右，温度设置为25 ℃。设定CO2的浓度梯度为50、100、200、300、400、600、800、1000、1200 和1500 μmol·mol-1，设置不同CO2浓度数据采集时间为120~300 s。自动测量系 统 记 录 净 光 合 速 率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸 腾 速 率（transpiration rate，Tr）、气 孔 导 度（stomatal conductance，Gs）、胞间CO2浓度（intercellular CO2concentration，Ci）等气体交换参数，计算水分利用效率（water use efficiency， WUE），公式为WUE=Pn/Tr。

1.3 模型拟合

1.3.1 直角双曲线模型 直角双曲线模型[7］的表达式为：

式中：Pn为净光合速率；Ci为胞间CO2浓度；α为初始羧化效率；Rp为光呼吸速率；Pnmax为最大净光合速率。

1.3.2 非直角双曲线模型 非直角双曲线模型[27］的表达式为：

式中：θ为曲角。

1.3.3 直角双曲线修正模型 直角双曲线修正模型[28］的表达式为：

式中：β，γ 为修正系数。

1.3.4 Michaelis-Menten 模型 Michaelis-Menten 模型[10］的表达式为：

式中：K 为常数。

1.4 模型评价

采用均方根误差（root mean square error， RMSE）、平均绝对误差（mean absolute error， MAE）和决定系数（coefficient of determination，R2）评价4 种模型的拟合优度。计算公式如下[29］：

式中：yo，i和ym，i分别为净光合速率的实测值和拟合值；n为样本数。

1.5 数据处理与分析

光合-CO2响应曲线的拟合在叶子飘[30］开发的光合计算软件（4.1.1 版本）中完成。其中直角双曲线修正模型的Cisat和Г由软件直接得出。通过求解直线方程：Pnmax=α×Cisat-Rp求出直角双曲线模型、非直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型的Cisat，其中α为初始羧化效率，表示CO2浓度≤200 μmol·m-2·s-1时的直线方程的斜率。采用Excel 2016 进行数据处理，采用Origin 2021 绘图。

2 结果与分析

2.1 不同模型对CO2响应曲线的拟合效果及拟合优度

由表1 可以看出，非直角双曲线模型的α和Rp拟合值与实测值更接近，另外3 种模型的参数拟合值均大于实测值。Cisat、Г和Pnmax拟合值中，最接近实测值的模型均为直角双曲线修正模型。以AN5为例，直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型的Cisat拟合值均低于实测值66.88%，非直角双曲线模型的Cisat拟合值低于实测值36.07%，这3 种模型的Г拟合值均低于实测值5.00%左右，直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型的Pnmax拟合值均高于实测值70.14%，非直角双曲线模型的Pnmax拟合值高于实测值15.66%。综上，非直角双曲线模型对α和Rp的拟合效果最好，直角双曲线修正模型拟合的Cisat、Г和Pnmax的结果最理想。

表1 羊草光合-CO2响应曲线参数实测值与拟合值Table 1 The measured values of photosynthetic-CO2 response curve parameters of L. chinensis and the fitted values by models

在不同氮浓度和刈割处理下，羊草CO2响应曲线均能由直角双曲线修正模型较好的拟合，非直角双曲线模型的拟合效果次之，而直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型的拟合点普遍偏离实测点，尤其不能很好地拟合CO2饱和时的抑制现象（图1）。因此从宏观拟合情况来看，直角双曲线修正模型的拟合效果优于其他3 种模型。通过RMSE、MAE 和R2进一步评估4 种CO2响应模型的拟合优度（表2），从RMSE 和MAE 的评价结果来看，直角双曲线修正模型的值最小，因此其拟合优度好于其他3 种模型。从R2评价的模型拟合效果来看，直角双曲线修正模型的R2均在0.985 以上，且不同处理下直角双曲线修正模型的R2均高于其他模型或差值较小。综上所述，直角双曲线修正模型的拟合优度最高。

图1 氮添加和刈割处理下不同CO2响应模型对羊草光合作用-CO2响应曲线的模拟Fig. 1 Simulation of photosynthetic-CO2 response curves of L. chinensis by different CO2 response models under nitrogen and mowing treatments

表2 4 种CO2响应模型拟合优度对比Table 2 Comparison of goodness-of-fit on four CO2 response models

2.2 氮添加和刈割处理下羊草的CO2响应变化趋势及特征参数比较

根据上述不同CO2响应模型的拟合优度分析结果，在比较氮添加和刈割处理下羊草光合作用-CO2响应变化趋势时采用直角双曲线修正模型的拟合值（图2A）。结果显示不同处理的羊草CO2响应曲线具有明显差异，且波动范围较大。在CO2浓度≤400 μmol·mol-1时，所有处理的Pn均表现为随CO2浓度的增加而迅速上升的趋势。在非刈割处理中，当CO2浓度>400 μmol·mol-1时，AN20处理下的Pn上升幅度最大，而氮浓度低于或高于20 g N·m-2·a-1处理的Pn均低于AN20处理。刈割增大了所有处理的曲线上升幅度，使刈割处理的Pn表现为整体高于非刈割处理，且20 g N·m-2·a-1处理的羊草Pn较高。除MN20处理外，其他处理的羊草CO2响应曲线均表现出高CO2浓度的抑制现象。综合来看，MN20处理下的羊草表现出最强的光合能力，N20是羊草CO2利用率最高的氮素临界值。

图2 不同氮添加和刈割处理下羊草光合-CO2响应曲线Fig.2 Photosynthetic-CO2 response curves of L. chinensis under different nitrogen and mowing treatments

随CO2浓度升高，羊草Gs和Tr的CO2响应曲线整体呈下降趋势（图2B、D）。不同处理间，羊草Gs和Tr的响应规律与Pn并不一致，如AN20处理的Pn并不是涨幅最高的处理，而其Gs却处于最高水平，这说明羊草光合能力的高低并不由气孔的闭合程度所决定，而是由非气孔因素主导[31］。与不施氮相比，施氮处理的羊草Tr明显增加。随CO2浓度增加，所有处理的羊草Ci均呈基本的线性上升趋势（图2C）。氮添加增大了羊草Ci响应曲线的增长幅度。与非刈割相比，刈割处理后羊草Ci明显增加，且不同氮处理间差异较小。图2E 为氮添加和刈割处理下羊草WUE 的CO2响应过程。在低CO2浓度时（0~400 μmol·mol-1），WUE 迅速上升，而后随CO2浓度的增加，MN20处理的羊草WUE 处于较高水平，当CO2浓度达到最大时（1500 μmol·mol-1），MN20处理的羊草WUE 最高。

通过比较4 种模型的参数拟合效果，本研究采用非直角双曲线模型的α和Rp拟合结果，以及直角双曲线修正模型的Cisat、Г和Pnmax拟合结果进行光合参数分析（表1）。最大净光合速率（Pnmax）反映了叶片的光合电子传递和磷酸化活性[32］。在所有处理中，MN10和MN20的Pnmax相差不大且远高于其他处理，分别比光合能力最低的AN0处理高135.62%和127.23%。初始羧化效率（α）反映了核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（rubisco）的活性大小及含量多少，α的大小与rubisco 活性成正比[33-34］。随氮浓度升高，羊草α逐渐增大，但过度氮添加并不能进一步提高羧化效率，反而使α有所降低。非直角双曲线模型中，非刈割和刈割处理下α的浮动范围分别为：0.03~0.10 mol·m-2·s-1和0.04~0.06 mol·m-2·s-1。其中，MN10处理的α处于较高水平（0.06 mol·m-2·s-1），这可能是MN10光合速率较高的原因之一。

CO2饱和点（Cisat）是衡量植物利用高浓度CO2能力的一个指标。直角双曲线修正模型中，AN0处理的羊草光合能力虽然是最低的，但其具有最高Cisat，这可能是植物在养分贫瘠下维持正常生长发育的一种策略。CO2补偿点（Γ）反映叶片光合同化作用与呼吸消耗相当时的CO2浓度[30］。在相同氮浓度下，刈割处理的羊草对低CO2浓度的利用能力更强，与非刈割时的AN20处理相比，MN20处理的Γ降低了16.36%，说明MN20处理的羊草能在较低的CO2浓度下进行有机物质的积累。AN20处理的羊草具有最高的光呼吸速率（Rp），表明此时羊草在光合作用过程中通过消耗过剩光能以保护光合机构免受高温或强光损害，维持较高的光合速率，增加有机物生产与积累[11］。

3 讨论

在本研究中，4 种模型对不同参数的拟合效果存在差异：在对α和Rp的拟合中，非直角双曲线模型的拟合效果最好，其他3 种模型的拟合值普遍偏高，误差较大。在对Cisat、Г和Pnmax的拟合中，直角双曲线修正模型拟合值最接近实测值，这主要是由于其他3 种模型无法直接模拟出Cisat和Pnmax，而必须通过非线性最小二乘法估算Pnmax和假定0.9Pnmax对应的CO2浓度来求解Cisat，这就容易与测定值产生偏差[35］。而之所以非直角双曲线模型的拟合效果优于直角双曲线模型，是因为其在直角双曲线模型的基础上加入了曲线凸度这个参数，使结果更接近实测值[36］。此外，利用RMSE、MAE 和R2对4 种模型进行拟合优度比较后发现，直角双曲线修正模型对氮添加和刈割处理下的羊草光合-CO2响应曲线模拟效果最好。这是由于直角双曲线模型、非直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型都是一条没有极值的渐进线，无法很好地模拟CO2饱和的现象，估算的参数将远大于实测值[37］。而直角双曲线修正模型能很好地模拟Pn在CO2饱和时的下降趋势，因此Cisat和Pnmax的拟合值也更准确。目前，直角双曲线修正模 型 同 样 在 刺 槐（Robinia pseudoacacia）[38］、苹 果（Malus domestica）[39］、烟 草（Nicotiana benthamiana）[40］、黄 柳（Salix gordejevii）[11］、黄菇娘（Physalis pubescens）[41］等植物的CO2响应曲线拟合上表现出较好的拟合度。综上所述，在对羊草进行CO2响应曲线拟合时，可以结合非直角双曲线模型和直角双曲线修正模型的优势：利用非直角双曲线模型拟合的α和Rp与直角双曲线修正模型拟合的Cisat、Г和Pnmax进行参数分析，采用直角双曲线修正模型进行响应曲线趋势的拟合分析。

光合作用控制着植物生长及其生物量分配等关键环节[13］。本研究表明，在CO2浓度为0~400 μmol·mol-1时，Pn随着CO2浓度的增加而增加，基本呈直线上升趋势，此时曲线的斜率可表征rubisco 的效率。适量施氮增加了羊草α，在AN20处理下达到最大值，表明适宜的施氮量增加了CO2对rubisco 酶结合位点的竞争，从而提高了羧化效率，增强羊草对CO2的利用，产生较多的干物质[42］。同时AN20处理的Rp几乎是其他处理的2~3 倍，这也说明了植物在应对环境变化时，进化出了应对策略。AN50处理的α有所下降，可见过度氮添加并不能进一步提高羧化效率。刈割在一定施氮量时对羧化效率有进一步的促进作用（0~10 g N·m-2·a-1），MN10处理的羊草羧化效率相比AN10提高74.71%。并且此时WUE 与Pn的响应一致，表明随着CO2浓度的增加，羊草叶片在增加碳固定量的同时，也减少了水分的散失。Tr的响应趋势与Pn相反，说明羊草净光合速率的增加主要受非气孔因素的影响[43］。当CO2浓度>400 μmol·mol-1时，羊草净光合速率增幅变缓，有些处理的光合速率在达到最大值后呈下降趋势，因为此时叶绿体内由于光合作用合成了大量淀粉及1，5-二磷酸核酮糖（ribulose 1， 5-bisphosphate，RuBP）再生过程受限，因此抑制了光合作用的进行[13，44］。在相同CO2浓度条件下，施氮处理的羊草净光合速率大于不施氮处理，AN0处理的净光合速率随CO2浓度上升的幅度明显小于其他加氮处理，且AN20处理的羊草具有较高的光合潜能和对低CO2浓度的利用能力，说明氮添加增强了羊草叶片RuBP 羧化酶活性与碳同化能力[45］。CO2是植物光合作用的关键底物，本研究发现适度氮添加能提高羊草的净光合速率、水分利用效率、最大光合潜力、rubisco 活性及对更高和更低CO2浓度的利用效率，这有利于提高羊草碳固定，促进草原生态系统碳固存和碳循环。刈割是一种常见的草地管理方式，对氮添加条件下的羊草光合作用产生重要影响。结果表明，刈割提高了羊草净光合速率随CO2浓度升高的增长幅度，低氮添加处理（MN0、MN2、MN5）的增幅相近，差别不大，但中等浓度氮添加处理（MN10、MN20）的羊草净光合速率增幅较大，特别是MN20处理的羊草具有较高的光合潜力、更高的CO2的利用效率、水分利用效率以及光呼吸速率。这说明刈割通过带走地上生物量，促进了植株再生和对养分的吸收，减少了水分耗散并减少碳损耗[46］。但这种效果只能在中等氮浓度下发挥作用，因为MN50处理的羊草净光合速率已降低到低氮添加水平。因此，对草原生态系统来说，适量氮添加并刈割最有利于提高植物光合作用，这可能会增大草原生态系统的生产力或碳固持能力。本研究对今后草原管理措施的制定提供了试验依据。

4 结论

非直角双曲线模型的α和Rp与直角双曲线修正模型的Cisat、Г和Pnmax参数拟合效果较好，直角双曲线修正模型的模型拟合优度最高。通过对羊草的CO2响应曲线和拟合参数分析可知，外界CO2的变化可能会对羊草光合作用产生较大的影响，氮添加和刈割会改变羊草对CO2浓度变化的响应策略。合理的施氮浓度（20 g N·m-2·a-1）结合刈割能使羊草叶片的光合能力得到提升，且提高CO2利用效率。研究结果将为理解氮添加和刈割作用下羊草光合特性的响应规律提供理论依据，也为提高内蒙古草原生态系统碳固定制定合理的草原管理措施提供参考。