基于SSR 分子标记的自然状态下蕨麻采样策略研究

田甜，李军乔，马斌，王鑫慈，曲俊儒

（1. 青海民族大学生态环境与资源学院，青海 西宁 810007；2. 青海省特色经济植物高值化利用重点实验室，青海 西宁 810007；3. 青藏高原蕨麻产业研究院，青海 西宁 810007；4. 青海省湟源县种子站，青海 西宁 811699）

蕨麻（Potentilla anserina）属蔷薇科（Rosaceae）委陵菜属，是鹅绒委陵菜的变种。鹅绒委陵菜在世界及中国分布广泛，只在青藏高原等高寒地区根系才膨大为块根，称为“蕨麻”。蕨麻块根为圆球状、纺锤状或棒状，可食用或药用，俗称“人参果”“延寿果”，《晶珠本草》《西宁府新志》《中国藏药志》《四部医典》中均有记载[1-5］。据本课题组测定，块根富含淀粉、蛋白质、氨基酸、矿质元素、多糖、皂苷、总黄酮和鞣质等营养及活性成分，质糯，味甜，口感佳，具有抗缺氧、增强免疫力、保肝护肝、干扰病毒复制、抑制肿瘤细胞生长等功效[6-10］。民间将其作为食品及藏药已经使用了上千年，市场价值有增无减。农牧民将采挖野生蕨麻作为主要的经济来源，导致当地生态环境的恶化，野生蕨麻储藏量和品质逐年下降。为了解决生态、生产和发展的矛盾，本课题组对蕨麻进行了人工驯化、品种审定，通过20 年的研究，蕨麻种植已成为青海省和甘肃省的一个产业。

蕨麻系典型的克隆植物，具有丰富的匍匐茎，人工栽培条件下以无性繁殖为主。无性繁殖时，由块根长出基株，基株向四周生长出10~20 条一级匍匐茎，紫红色或绿色，生长迅速，匍匐茎每隔3~5 cm 生长出一个分株，分株处又生长出2、3 级匍匐茎。一株蕨麻一年生长量可覆盖3~5 m2土地。每个分株下的根系均可膨大，来年每个块根均可作为基株继续繁殖，如此周而复始，覆盖面积逐年增大，野外条件下具体繁殖面积不明。蕨麻还具有完整的花器，花冠5 枚，雄蕊和雌蕊20 枚以上，可产生生物学种子。人工条件下花朵种子结实率不足10%，种子萌发率约为2%，难以成活。课题组前期试验结果表明，蕨麻有性和无性繁殖并存，人工栽培时，蕨麻繁殖以无性为主，自然条件下，无性和有性繁殖比率相当，有性繁殖占比高于人工栽培，花粉传播主要依靠昆虫[11］，传播距离不明。由于野外条件下蕨麻生长了几千年甚至上万年，每年蕨麻都以无性繁殖及有性繁殖方式进行繁殖，个体遗传距离不明确，更无法确定野外状况下的采样距离，导致采样时居群内个体间和居群间的距离无法确定，对采样及遗传分析造成了极大的困扰。

目前对于蕨麻有性繁育和遗传学方面的研究较少，课题组通过对蕨麻简单重复序列（simple sequence repeat， SSR）研究发现，地理距离较远的两个样本在亲缘关系上可以非常近，聚为一支[9，12］，这与蕨麻是兼性克隆植物有关[13］。SSR 多用于研究物种遗传多样性、指纹图谱、遗传结构等，马斌等[14］利用SSR 分子标记构建了蕨麻3 个品种的指纹图谱，魏姗姗等[15］用SSR 分子标记技术分析了95 份桃（Prunus persica）品种的遗传多样性。课题组使用磁珠富集法开发的SSR 引物，为蕨麻基因组学研究、育种进程提供了新的分子标记技术[12］。

野外采样时，如何有效避免采集的样品来自同一亲本，主要考虑因素为蕨麻无性繁殖距离为多远，是否存在有性繁殖，有性繁殖花粉能传播多远等。国内外关于蕨麻的研究主要侧重于克隆习性、化学成分、药理活性等方面，蕨麻栽培技术、生物学特性、有性繁殖、分子标记等方面的研究均为本课题组发表的论文，关于蕨麻采样策略的分子生物学研究未见报道[16-24］。蕨麻无性繁殖的距离在人工种植情况下从形态上难以区分蕨麻的不同亲本，而蕨麻种子结实率低，萌发率低，杂交不亲和，常规方法无法完成蕨麻有性繁殖的研究。为明确蕨麻个体和居群间的采样距离，本研究利用SSR 分子标记技术研究野生蕨麻的遗传相似性，确定自然状态下野生蕨麻的采样策略和距离，为野生蕨麻样品采集、选育和驯化等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况与试验材料

基于蕨麻在西北高原地区的分布面积，试验分别选取青海省、甘肃省、四川省和西藏自治区为主要地区，分别在不同地区选取不同的居群数量进行试验。2017 年5-7 月，采样路线及地点结合蕨麻分布面积和青藏高原山脉分布选定。甘肃省和四川省蕨麻分布面积小，各设置1 个居群，甘肃省为碌曲县（原点：34°48′54″E，102°43′38″N），四川省为若尔盖县（原点：33°59′52″ E，102°46′14″ N）；青海省和西藏自治区蕨麻分布面积大，各设置2 个居群，青海省为河南县（原点：34°47′21″ E，101°33′06″ N）和祁连县（原点：37°38′35″ E，101°25′31″ N），西藏自治区为八宿县（原点：31°20′51″ E，97°36′27″ N）和南木林县（原点：29°33′59″ E，89°04′32″ N）。样品采集共6 个居群。采样方法为选取一个原点，沿直线采样。其中，由于青藏高原海拔高、地形复杂，山脉众多，蕨麻居群采样并不完全是直线（采样分布见图4，图6，图8，图10，图12 和图14）。

图1 6 个蕨麻居群的UPGMA 聚类树Fig.1 UPMGA cluster trees for six P. anserina populations

采样时，以第一个采样点为原点，后分别在距离原点1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80、90、100、120、150、160、200、250、300、400、500、1000、1500、2000、2500、5000、10000、15000、20000、30000、40000、50000 m处采样，1000 m 以内的距离用测轮测量，1000 m 以上的距离用汽车测量。采集新鲜、无病斑、幼嫩的蕨麻叶片，放入硅胶袋中，备用。调查、记录每一个样本的采集地海拔和经纬度等信息。采样点基本信息见表1（伴生植物所列物种在所有采样点中均有）。

表1 采样点基本信息Table 1 Basic information of sampling points

1.2 试剂与仪器

1.2.1 DNA 提取试剂 1 mol·L-1Tris-HCL （pH 8.0）、0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）、5 mol·L-1NaCl、2×CTAB 缓冲溶液、氯仿/异戊醇（24∶1）、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、50×TAE 缓存溶液、4S Red Plus 核酸染色剂（10000×水溶液）、6×Loading buffer 上样缓冲液，试剂均为分析纯。

1.2.2 PCR 反应试剂 Taq 酶、dNTP、10×PCR Buffer，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2.3 试验仪器 GR60DP 高压蒸汽灭菌锅（ZEAL WAY INSTRUMENT INC）、Neofuge 23R 高速台式冷冻离心机（香港）、Scientz-192 高通量组织研磨仪（宁波）、MiniBIS pro 凝胶成像系统（以色列）、Mastercycle pro PCR 仪（德国）、3730XL3730XL 测序仪（美国）。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA 提取及检测 本试验采用试剂盒改良CTAB 法[25-26］提取6 个居群210 份样本的DNA。经1%琼脂糖凝胶检测DNA 浓度，用灭菌的去离子水稀释浓度至50 ng·μL-1，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 引物信息与SSR 标记扩增 试验所用引物为课题组已筛选出的具有高度多态性的SSR 引物[9，12］，具体信息见表2。

表2 SSR 引物序列信息Table 2 The information of SSR primer sequence

用筛选出的SSR 引物对210 个蕨麻个体材料进行SSR 扩增。PCR 扩增体系总体积为20 μL：Taq（5 U·μL-1）0.14 μL、dNTP（15 mmol·L-1）1.6 μL、Buffer（10×） 2.0 μL、正向引物（20 μmol·L-1）0.4 μL、反向引物（20 μmol·L-1） 0.4 μL、DNA（50 ng·μL-1）2.5 μL、ddH2O 12.96 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃（退火温度以优化的为标准）复性35 s，72 ℃延伸40 s，共35 个循环，最终72 ℃延伸3 min。PCR 产物保存备用。

1.3.3 毛细管电泳 将甲酰胺与分子量内标按体积比100∶1 混合均匀，在测序仪上样板中加入9 μL，再加入1 μL 稀释10 倍的PCR 产物[26］。毛细管电泳使用3730XL 测序仪进行，利用GeneMarker 中的Fragment（Plant）片段分析软件对得到的原始数据进行分析。比较各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置，分析片段大小[27］。

1.4 数据分析

利用GeneMarker 软件的等位基因峰图对210 份材料、20 对引物组合扩增得到的4200 个原始数据进行分析，根据扩增有条带和无条带统计数据，修正后（有条带为扩增阳性，记为1；相应位置无条带为扩增阴性，记为0）转为0/1 的数列格式，建立原始数列矩阵，利用POPGENE 32[28］、NTSYS-pc 2.10e[29］和GenAIEx 6.5[30］等软件进行后续分析。

利用POPGENE 32 软件对6 个居群210 份样本的原始（0，1）数值矩阵进行遗传多样性分析，并计算多态性指数（polymorphic information content， PIC）[31］，计算公式为：

式中：Pij表示标记i的第j个等位基因在群体中的分布频率；标记i的总等位基因为1~n[32］，n是等位基因数目。

利用NTSYS-pc 2.10e 软件对6 个居群210 份样本的原始（0，1）数值矩阵进行处理，运用clustering 程序中的SHAN 程序进行非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）聚类分析，绘制亲缘关系树状图。

运用GenAlEx 6.5 软件，依据居群遗传距离对6 个居群作主成分分析，同时进行空间自相关分析，以揭示空间距离和遗传距离之间的关系。

2 结果与分析

2.1 SSR 扩增结果

提取的DNA 质量为500 ng·μL-1以上，纯度为1.8，达到SSR-PCR 扩增条件。利用20 对核心引物对蕨麻210 份材料进行PCR 扩增，然后通过毛细管电泳检测分析。20 对引物一共扩增出93 个多态性片段（表3），扩增片段大小为78~306 bp。扩增片段最小引物为P40，最大引物是P24。在20 对SSR 位点共检测出93 个等位基因，每对引物检测出2~7 个等位基因，平均为4.65 个。20 个位点的多态性指数（PIC）变化为0.25~0.82，平均为0.61；SSR 引物P3 和P19 获得的等位基因数最多（7 个），PIC 值分别为0.82 和0.80；引物P34 获得的等位基因数最少（2个），PIC 值为0.25。PIC 值可作为判断SSR 引物多态性高低的指标[31］，本试验中90%以上的引物PIC>0.5，表明试验中所筛选的引物具有高度多态性，扩增结果可反映蕨麻资源的遗传多样性。

表3 20 对核心引物多态性指数Table 3 The polymorphic information content of 20 SSR primers

2.2 遗传多样性分析

利用POPGENE 32 软件分析得到蕨麻6 个居群的遗传参数（表4），祁连县居群（QLX）的遗传多样性最高[平均杂合度（average heterozygosity，H）=0.2797，香农指数（Shannon index，I）=0.4287］。河南县居群（HNX）的遗传多样性最低（H=0.2273，I=0.3542）。6 个居群遗传多样性由高到低依次为QLX>LQX>BSX>NMX>REG>HNX。

表4 6 个蕨麻居群的遗传多样性Table 4 Genetic diversity of the six P. anserina populations

利用GenAIEx 6.5 对蕨麻6 个居群进行AMOVA 分析，结果显示（表5），主要变异来源于居群内，占比84%，居群间占有16%的遗传变异。

表5 蕨麻6 个群体分子方差分析Table 5 AMOVA analysis of six P. anserina populations

通过计算群体间的遗传分化系数及基因流，河南县居群和碌曲县居群之间的基因流最大（Nm=0.986），说明两个居群之间进行基因交流的频率较多，从而使得遗传分化指数较低（Fst=0.014），这与遗传分析结果一致。八宿县居群和楠木林县居群之间的遗传分化指数最大（Fst=0.084），基因流最低（Nm=0.919），说明两个居群之间遗传多样性较低，大型山脉的阻隔可能为主要原因。同时，6 个居群之间的遗传分化指数（Fst）都小于0.1（<0.15），说明整体的遗传分化比较小。群体之间的基因流在0.900 以上，表示群体间遗传差异较小（表6）。

表6 蕨麻群体间的遗传分化系数和基因流Table 6 The Fst and Nm among P. anserina populations

蕨麻6 个居群的遗传相似度和遗传距离显示（表7），各居群间的遗传相似度高，为0.9194~0.9860，遗传距离也较近，为0.0141~0.0840。其中，碌曲县居群和河南县居群的遗传距离最小，遗传一致度最大；南木林县居群和八宿县居群遗传距离最大，遗传一致度最小。

表7 蕨麻各居群之间的遗传相似度与遗传距离Table 7 Genetic identity and genetic distance of six P. anserina populations

基于POPGENE 32 分析结果，在欧式聚类平均法（UPGMA）计算中得出，当遗传相似系数为0.98 时，6 个居群分为4 组（图1），南木林县（NMX）、祁连县（QLX）以及八宿县（BSX）各自单独聚类为一组，碌曲县（LQX）、河南县（HNX）和若尔盖县（REG）聚为一组（Cluster 2），各群体间距离依次增大，亲缘关系也逐渐变远。其中，Cluster 2 包括两个亚组，Cluster 2A 包括2 个群体，为碌曲县（LQX）和河南县（HNX），Cluster 2B 包括1 个群体，为若尔盖县（REG）。

利用GenAIEx 6.5 对6 个蕨麻群体的210 个样本进行主成分分析（图2），结果与聚类分析结果一致，碌曲县、河南县以及若尔盖县按照居群聚为一簇，这与其地理位置有关，中间没有横亘山脉，为其进行基因交流提供了便利；而遗传多样性较高的居群，如祁连县、南木林县和八宿县，由于居群内个体遗传背景差异较大，聚类较分散，均单独聚为一类。

图2 210 个蕨麻个体的主成分分析Fig. 2 PCoA analysis of 210 individuals in P. anserina populations

南木林县、祁连县以及八宿县分布较为分散，其间的大型山脉阻隔是主要原因。其中，南木林县和八宿县的个体最为分散，没有规律性，这可能与地理距离有关。

2.3 遗传采样策略

依据20 对引物对每个地区蕨麻样品的扩增点位，构建（0，1）的数列矩阵，利用NYSYS 2.1 对蕨麻6 个居群进行分析，对每个居群内的蕨麻样品进行UPGMA 聚类，并对各居群遗传距离矩阵和地理距离矩阵进行相关性计算（Mantel 检验）。

根据碌曲县蕨麻样品UPGMA 聚类（图3）可知，该地区蕨麻个体间遗传距离较近，遗传距离最大为0.58。根据聚类分析及采样点分布（图3 和图4），该地区蕨麻个体间遗传距离随地理距离的增大呈逐步增加的态势，且大概30 号以前的样品间遗传距离较近，而30 号以后的样品与30 号以前的样品间遗传距离逐步增大。以30 号样品为分界线，分别为5 km 以内的个体与5 km 以上的个体，表明在一定范围内为同一克隆的可能性更大。遗传距离和地理距离相关性显示（图4），R²=0.0086，P=0.13>0.05，两者之间没有显著的联系。表示聚类并不完全按照地理距离进行，蕨麻个体与地理距离相关性较差，这与采样个体分布于盘山地区，没有较强的地理隔离有关。

图3 甘肃省碌曲县蕨麻样品UPGMA 聚类分析Fig.3 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Luqu County， Gansu Province

图4 甘肃省碌曲县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 4 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Luqu County， Gansu Province

根据若尔盖县（REG）蕨麻样品UPGMA 聚类（图5）得出，群体内遗传距离较近，遗传距离最大为0.60。根据聚类分析及采样点分布（图5 和图6）得出，该地区蕨麻个体采样点均分布于较为平坦的山丘地区，遗传距离和地理距离相关性显示（图6），R²=0.0248，P=0.06>0.05，两者之间没有显著的联系，表明该地区的蕨麻个体间遗传距离与地理距离相关性较差，且蕨麻个体间遗传距离较为复杂。该居群的平均杂合度（H）、香农指数（I）高达0.2407 和0.3709（表4），表示其遗传多样性较高，这与该地区地势较为平坦，且多为草原地带，蕨麻个体间无明显的地理隔离，导致基因交流较频繁有关。

图5 四川省若尔盖县蕨麻样品UPGMA 聚类分析Fig.5 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Ruoergai County， Sichuan Province

图6 四川省若尔盖县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 6 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Ruoergai County， Sichuan Province

根据河南县蕨麻样品UPGMA 聚类（图7）可知，该地区蕨麻遗传距离较近，遗传距离最大为0.59。根据聚类分析及采样点分布（图7 和图8），在遗传距离为0.76 处，以30 号蕨麻样品为分界线，蕨麻样品被聚为两类，分别为5 km 以内的蕨麻个体与5 km 以上的蕨麻个体。遗传距离和地理距离相关性显示（图8），R²趋近于0，P=0.45>0.05，两者之间没有显著的联系，这与该地区蕨麻采样点分布于较平坦的地区，沿直线排布有关，无明显地理隔离导致蕨麻个体间基因交流较多。

图7 青海省河南县蕨麻样品UPGMA 聚类分析Fig.7 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Henan County， Qinghai Province

图8 青海省河南县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 8 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Henan County， Qinghai Province

根据祁连县蕨麻样品UPGMA 聚类（图9）可知，该地区蕨麻遗传距离较近，遗传距离最大为0.54。根据聚类分析及采样点分布（图9 和图10）可知，1~29 号样品被明显聚为一类，这些样品的采样点均为5 km 以内，30~36号样品被聚为一类，这些样品采样点距离均为5 km 以上。遗传距离和地理距离相关性显示（图10），R²=0.1982，P=0.01<0.05，两者之间有显著的联系，表明该地区蕨麻个体样品间遗传距离也随着地理距离的增加而增大。该地区蕨麻采样点分布较均匀，并按照一定的直线排布，蕨麻个体间遗传距离与地理距离相关性较好。

图9 青海省祁连县蕨麻样品UPGMA 聚类分析Fig.9 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Qilian County， Qinghai Province

图10 青海省祁连县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 10 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Qilian County， Qinghai Province

根据八宿县蕨麻样品UPGMA 聚类（图11），蕨麻遗传距离较近，遗传距离最大为0.63。由聚类分析及采样点分布（图11 和图12）可知，该地区蕨麻个体采样点均分布于山谷中间，且地势较复杂。遗传距离和地理距离相关性显示（图12），R²=0.0118，P=0.16>0.05，两者之间没有显著联系。蕨麻个体间遗传距离与地理距离相关性较差。由于西藏八宿县位于横断山脉，地理情况较为复杂，且该地区为冰川期野生植物的避难所，遗传多样性较丰富，基因交流较为频繁，但该地区部分蕨麻个体采样点分布不是按照直线排布，所以出现蕨麻个体间遗传距离与地理距离无明显相关的现象。

图12 西藏自治区八宿县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 12 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Baxoi County， Tibet Autonomous Region

根据南木林县蕨麻样品UPGMA 聚类（图13）可以得出，该地区蕨麻遗传距离较近，遗传距离最大为0.54。根据聚类分析及采样点分布（图13 和图14）可知，该地区蕨麻个体间遗传距离随地理距离的增加而增大，具有一定的相关性。蕨麻个体间遗传距离均较近，5 km 以上的蕨麻个体与5 km 以内的蕨麻个体遗传距离较近，并没有明显的距离划分。遗传距离和地理距离相关性（图14）显示，R²=0.0204，P=0.13>0.05，两者之间没有显著联系。蕨麻个体间遗传距离与地理距离相关性较差。这与该地区呈两边为高山，中间为狭长的河谷地区，蕨麻个体间基因交流并无明显的阻隔有关。

图13 西藏自治区南木林县蕨麻样品UPGMA 聚类分析Fig.13 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Nanmulin County， Tibet Autonomous Region

图14 西藏自治区南木林县蕨麻遗传距离与地理距离相关性分析及采样路线Fig. 14 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Nanmulin County， Tibet Autonomous Region

3 讨论

3.1 遗传多样性分析

本试验使用20 对SSR 引物对蕨麻6 个居群210 个样本进行PCR 扩增，共扩增出93 个多态性片段，平均PIC值为0.6145，根据Botstein 等[31］的划分标准，20 对引物平均表现出高多态性，表明这些位点可用于蕨麻种质的遗传多样性分析。

多态位点百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）在一定程度上可以反映物种的遗传多样性[33］，两者一般呈正相关，PPB 越大说明物种对环境适应得越好，容易扩展其分布范围和开拓新的环境，遗传多样性也越丰富。本研究中各居群的PPB 均在80%以上，最高达91.40%（碌曲县），说明蕨麻的遗传多样性丰富。蕨麻具有较高的遗传多样性，同时也具有中等水平的遗传变异。一般认为，克隆植物遗传多样性都比较低[34］，但在蕨麻中显示出了不同的结果。越来越多的研究表明克隆植物的种群也可以保持很高的遗传多样性，兼性有性生殖可以有效补偿遗传变异的损失，在种群内提高遗传变异，以此来消减种群间的遗传变异；或者通过基因突变来提高遗传变异，如三叶 草（Trifolium）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）等[35］。刘春 香等[36］对 匍匐茎克 隆植物蛇 莓（Duchesnea indica）的研究发现，33 个野生蛇莓种群也具有很高的遗传多样性，遗传距离与地理距离不存在显著相关关系（r=0.052，P=0.150），这与蛇莓的无性繁殖以及对环境压力的选择有关。蕨麻遗传多样性高的原因可能为蕨麻是兼性克隆植物，种群内可以通过风媒、虫媒在长距离范围内进行花粉传播，从而增加居群内的基因交流；蕨麻在高寒地区生长，周边环境一般为山脉，阻碍了花粉和种子的传播，且克隆生长受到限制，从而将居群之间分隔开来，形成生境隔离，各居群为适应不同环境而形成不同的进化；同时，采样时各居群的地理环境不同，由于山脉、河流隔断，大多数样本不是直线距离采集，最终形成蕨麻的高遗传多样性。

蕨麻遗传变异主要来源于居群内（居群变异方差和占比分别为12.745 和84%），居群间变异较低（居群变异方差和占比分别为2.477 和16%），这与杜夏瑾等[37］的研究结论一致。金燕等[38］认为，一个物种的分布区域大小可以直接影响其遗传多样性的高低，两者成正比，分布区域广的物种会由于宽阔的生境之间的差异而进化，从而提高遗传变异。蕨麻本身为克隆植物，单个居群占地面积也较广，在一个区域内，覆盖率可达100%，在自然生长的居群中，充分发挥繁殖优势，分布范围广，但由于是在高寒地区，生境差异大，为适应环境而变异，这也是自然选择的结果。青藏高原山脉平均海拔4000~6000 m，距离地面高度平均为1000~1500 m（唐古拉山脉高6800 m，距离地面高度1800 m，昆仑山脉高5500~6000 m，距离地面高度1200~1700 m，祁连山脉高5800 m，距离地面1000~2000 m），各地区环境、气候差异大。本研究发现，各居群间、居群内均有大小不同的山脉作为阻断，且采样时由于地势的不一致，所采集的样品并不能按照直线进行采集，从而使得群体的遗传多样性较高，居群内遗传背景变大。

采样区域内从南到北分布的大型山脉有喜马拉雅山脉、横断山脉、昆仑山脉和祁连山脉，唐古拉山脉和巴颜喀拉山脉为小型山脉。南木林县居群与其他5 个居群遗传距离最远，该居群位于拉萨以西，周边环绕着横断山脉、唐古拉山脉、巴颜喀拉山脉等数条大型山脉，山脉阻隔最显著，地理距离最远，遗传距离也最远；八宿县位于昌都以南，周边环绕横断山脉，使得该区蕨麻与其他地区具有天然的生殖隔离屏障，地形最为复杂，遗传多样性丰富，该区和其他地区地理隔离也很明显；祁连县与上述两个地区地理距离较远，且中间横亘昆仑山脉和祁连山脉，遗传距离较远，但由于其采样时分布较均匀，按照直线进行采样，其遗传多样性较为丰富，遗传距离和地理距离呈显著相关；若尔盖县位于昆仑山脉和横断山脉之间，山脉阻隔，遗传距离和地理距离具有一定相关性；碌曲县居群和河南县居群位于昆仑山脉和祁连山脉中间，没有山脉阻隔，遗传距离最近，遗传一致度最高（遗传相似系数=0.986，遗传距离=0.0141），且聚类为一簇。

3.2 遗传采样策略

克隆植物的遗传距离对植物种质资源收集具有很重要的作用，沈晓婷[33］对克隆植物毛竹（Phyllostachys edulis）的研究发现，毛竹的单个克隆最大延伸距离可达1448 m，这为毛竹的资源整合提供了一定的理论基础。蕨麻是典型的克隆植物，在野外长年的生长增大了繁殖面积，一定程度上也影响着遗传距离的大小。6 个蕨麻居群不同距离分布的个体聚类结果表明，每个地区1~30 号样品间地理距离较短，均在5 km 以内，31~36 号样品间，地理距离较远，均在5 km 以上。其中，祁连县居群蕨麻个体间遗传距离与地理距离相关性最好，可以明显看出，同一地区蕨麻居群内，蕨麻个体间遗传距离随地理距离的增加，呈增大的态势，其中1~30 号样品的遗传距离较近，31~35 号样品间遗传距离较远，根据地理距离分布，可划分为5 km 以内的样品个体和5 km 以上的样品个体。其他地区遗传距离与地理距离的相关性虽然不是很大，但根据居群聚类分析可以得出，5 km 是一个分界点，即5 km 可以作为一个克隆的延长距离。

由于在实际采样过程中，地理情况和采样点的分布情况均较为复杂。祁连县的蕨麻个体间遗传距离与地理距离表现出较好的线性关系（R²=0.1983，P=0.01<0.05），其遗传距离和地理距离呈正相关，且遗传多样性最高（H=0.2797，I=0.4287）。而其他居群蕨麻个体间遗传距离并不是按照地理距离线性排布，造成该情况的发生可能有以下几点原因：首先，不能排除蕨麻生长过程中出现种子传播的可能性；其次，蕨麻是无性繁殖为主，有性繁殖为辅，这会导致野生蕨麻具有基因交流的过程；最后，蕨麻采样过程中，同一居群内虽然有地理海拔差距，但并没有大型的山脉等明显的地理隔离，使居群内部没有产生生殖隔离，所以同一地区的蕨麻遗传距离较近，从而降低了与地理距离的相关性。

根据居群聚类结果可知，蕨麻聚类一般以地理距离和地理阻隔结合进行聚类，碌曲县和河南县两个居群地理位置近，聚为一支（遗传距离=0.0141，遗传相似系数=0.986），可能是因为该地势较为平坦，利于虫媒、风媒的传播，增加两个居群之间的基因流[39］，从而使得两个居群之间变异少，聚为一支。碌曲县与若尔盖县地理位置也近，但由于有大巴山脉（海拔为2000~2500 m）作为阻隔，阻碍了有性繁育花粉的传播，减少了基因流，使得其没有聚在一起（遗传距离=0.0256，遗传相似系数=0.9747）。南木林县、祁连县、八宿县3 个居群之间的聚类也较远，其间不仅地理距离远，更有大型山脉作为阻隔，阻断了居群之间的交流。由此可看出，居群可以以大型山脉进行区分。

4 结论

结合采样点地理分布、遗传多样性和聚类分析可知：1）当采样地势较为平坦时，可以有效增加居群间的基因交流，在采样时，需要增大居群之间的距离以避免采集为同一亲本。碌曲县和河南县两个地区的直线距离为100 km，两个居群遗传距离相似度最高，因此在没有大型山脉隔离的情况下，蕨麻有性繁殖即花粉传播距离可能达到100 km，花粉在两地之间进行长距离传播，促使居群之间基因交流，从而使得两地的遗传关系近，该距离可以作为在没有大型山脉隔离条件下，蕨麻居群间采样的最小距离；2）当有山脉作为采样隔断时，居群之间的地理距离即使比较近，但由于山脉的阻断，居群之间的基因流降低，生境的隔离也成为居群之间变异较大的重要原因，因此，山脉隔断可以有效避免采集样本来自同一居群，居群间采样应该以翻越青藏高原大型山脉后采集样品为宜；3）根据居群内聚类分析可以得出，多个居群中均显示，30 号样品之前大多聚在一起，地理距离在5 km 之内，而在5 km之外的样品则单独聚在一起，说明在一定范围内（5 km 左右）的分株都来源于同一亲本。因此采样时，一个居群内个体间的距离至少达到5 km 。

根据研究结果，对6 个野生蕨麻居群，提出针对性保护建议：除了主要采取就地保护策略保障其原始居群的遗传多样性外，还可以适当对不同地区蕨麻种质资源进行迁地保护，维持其基因流的稳定性。蕨麻在西部地区生长好，且在海拔1700 m 以上地区块根才膨大，西部地区大部分位于我国第一阶梯，海拔较高，最合适蕨麻生长，且蕨麻繁殖扩增的模式也能为西部地区贫瘠土地的修复带来良好的生态效益。同时，蕨麻在农牧民日常生活中既可以作为食品食用，也可以作为商品进行售卖以增加收入，因此在西部地区，蕨麻在秋季时会受到大面积的采挖，采挖过后的蕨麻来年生长势急剧下降，从而影响其生态修复能力。因此，提出以下建议，比如青海省内蕨麻居群遗传多样性高的祁连县居群、甘肃省的碌曲县居群以及西藏自治区的八宿县居群，可以将蕨麻现有居群建立自然保护区，适当开展迁地保护，规划采挖区域，以减少过度采挖对蕨麻多样性和生态的破坏。遗传多样性较低的居群，比如河南县居群、若尔盖居群，可以对其进行种质筛选，培育出纯品种，将其作为一个品种来进行研究，发掘其药用、食用以及生态价值。同时，研究中也发现同个省份内不同居群之间遗传多样性有差异，本试验在同一省份内采样居群数量较少，只能部分概括同一区域内的遗传多样性结果，在后续研究中，可以对某一区域通过不同种群野生资源进行遗传资源研究，通过分子生物学方法探究其遗传多样性，探讨其不同海拔下不同自然居群的遗传多样性，从不同生境下居群的遗传结构进行分子变异分析，再确定其保护策略。