交通任督针刺法对血管性痴呆大鼠CA1区脑源性神经营养因子及学习记忆功能的影响

李新华,郭 霞,赵立新

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由各种复杂的脑血管因素引起的脑组织损害而造成以认知功能障碍为主要临床表现的一种痴呆综合征[1],是老年人群的常见病、多发病,是仅次于阿尔茨海默病的痴呆[2]。血管性痴呆作为目前唯一一种可以预防的痴呆类型,如果及早发现、早期诊断明确、及时干预治疗,血管性痴呆是可以防治的,是可逆的[3],但到目前为止,仍没有统一和有效的治疗方法[4]。因此,对于血管性痴呆防治的临床研究及实验研究具有相当重要的现实意义。“交通任督”针刺法是山西省中医院原针灸科主任郭耀康教授在长期针灸临床实践中创立的针灸理论和疗法,并将其应用于治疗血管性痴呆,疗效显著。随着对血管性痴呆发病机制的不断深入研究,脑源性神经营养因子在血管性痴呆发生发展过程中所发挥的作用越来越受到重视。本研究采用永久性结扎双侧颈总动脉(改良2-VO)法复制全脑缺血模型,以“交通任督法”取风府、百会、人中、关元、中脘穴位进行针刺干预,观察其对血管性痴呆大鼠空间学习记忆功能、海马CA1区组织细胞形态学及脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,探讨交通任督针刺法干预血管性痴呆大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SD大鼠60只,雄性,月龄2～3个月,体质量(210±10)g。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2019-0004。按照随机数字表分为空白组(12只)、假手术组(12只)和手术组(36只)。

1.2 实验药品及试剂

尼莫地平片(商品名:尼膜同,拜耳医药保健有限公司生产),注射用青霉素钠[中诺药业(石家庄)有限公司],BDNF抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),BDNF二抗(BiOS公司),聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Solarbio公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(SEVEN公司),十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速凝胶配置试剂盒(SEVEN公司),彩虹130广谱蛋白Marker(Solarbio公司),β-actin内参引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],超敏增强型化学发光试剂(ECL)检测试剂盒(赛文生物技术有限公司)。

1.3 实验材料及仪器

汉医牌一次性使用无菌针灸针(长春爱康医药器械有限公司,规格为0.25 mm×13 mm);Morris水迷宫(型号:DMS-2,中国医学科学院药物研究所);全自动全封闭脱水机(型号:Excelsior,美国Thermo公司);石蜡包埋机(型号:TKY-BMB,湖北康泰医疗设备有限公司);包埋专用冷台(型号:TKY-BMB,湖北秦康医疗设备有限公司);旋转石蜡切片机(型号:F325,德国Thermo公司);摊片机(型号:TKY-TPA,湖北泰康医疗设备有限公司);烤片机(型号:TKY-TPA,湖北泰康医疗设备有限公司);万能荧光成像系统(型号:BX51-DP72,日本奥林巴斯);电热恒温鼓风干燥箱(型号:101-2-S,上海跃进医疗器械厂);低温台式离心机(型号:Auegrax-30K,美国 Beckman Coulter公司);脱色水平摇床(型号:TS-1000,海门市其林贝尔仪器制造有限公司);双向电泳系统(PROTEANi12 IEF Mini-PROTEAN Tetra PROTEAN 11 XL,美国Bio-Rad公司);半干式转印系统(TRans-Blot SemiDry PowerPac Universal,美国Bio-Rad公司);高性能成像分析仪(型号:HD2,美国ProteinSimple公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备

随机选取空白对照组、假手术组各12只,手术组36只大鼠采用改良2-VO法制备全脑缺血模型,在不同时点永久性结扎双侧颈总动脉[5-7],即采用每间隔3 d分2次永久性结扎大鼠双侧颈总动脉法制备模型。将大鼠用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉后,仰卧位固定在手术台上,常规消毒,颈正中切口,先分离一侧颈总动脉,用1号缝合线结扎两端,中间永久性剪断,缝合伤口,后肢肌内注射青霉素钠4×104U,放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上,但不阻断颈总动脉,间隔3 d后结扎、剪断另一侧颈总动脉。术后7 d切口愈合,进行Morris水迷宫测试,与造模前比较有明显的学习记忆障碍为成功制备血管性痴呆大鼠模型。痴呆标准以对照组大鼠逃避时间的均值为参考值,计算实验组大鼠各时段成绩的平均逃避潜伏期与参考值之差占该大鼠平均逃避潜伏期时间的比例,>20%确定为痴呆大鼠。

1.4.2 动物分组及给药

将造模后大鼠随机分为模型组、交通任督法针刺组(针刺组)、尼莫地平组。针刺组:取一次性使用无菌针灸针(规格0.25 mm×13 mm),参照林文注等编著的《实验针灸学》选穴:风府(天门)、百会、人中、关元、中脘,取穴及针刺法见表1,深度约0.5寸,平补平泻,留针30 min,每日1次,连续15 d。尼莫地平组:给予尼莫地平片12 mg/kg,按10 mL/kg体质量灌胃给药,每日1次,连续15 d。空白组、假手术组、模型组不做任何治疗。

表1 取穴及针刺法

表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行和空间搜索能力比较(±s)

1.5 观察指标

1.5.1 Morris水迷宫行为学测试

在造模前、造模后、治疗后分别进行水迷宫实验检测。定位航行实验(place navigation):历时5 d。正式实验时将平台固定在1个象限,位于水面下1.5 cm,水温稳定在(25.0±0.5)℃,实验室中物品和人员的位置在实验期间固定不变,作为动物的空间参照物。每天测试2次,每次从不同的入水点将动物面向池壁放入水中,检测时间为60 s,在平台上停留超过2 s则判定为寻台成功,将动物从入水到寻台成功所需的时间记作逃避潜伏期,若60 s内未找到平台则潜伏期记为60 s。每次测试前先将动物置于平台上停留15 s,称为适应,测试完毕不论寻台是否成功均适应10 s。计算每天潜伏期平均值,以评价动物空间记忆的获得能力。空间搜索实验(spatial probe):定位航行实验结束次日,拆除平台,选择某一象限作为入水象限,通过动物在60 s内穿过原平台位置的次数、原平台象限游程比率及时间比率来评价动物的空间记忆能力。

1.5.2 海马CA1区苏木精-伊红(HE)染色组织形态学观察

1)灌注取脑:各组大鼠于行为学检测结束后,腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉,打开胸腔,充分暴露心脏,自心尖插入灌注针头直至主动脉,剪开右心耳,开放静脉血。灌注生理盐水约200 mL至流出液澄清,换用4%多聚甲醛溶液继续灌注约300 mL进行前固定,至大鼠全身僵硬,肝脏发白为止。剪开皮肤暴露头及颈段,从颈椎处剪断颈髓,分离除去后颈部肌肉后用弯钳仔细剔除颅骨,从延髓开始,慢慢分离颅底组织,完整取出大脑放入4%多聚甲醛中后固定备用。2)石蜡包埋与切片。3)HE染色观察:常规脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片。4)光镜下观察海马组织结构的形态学变化。

1.5.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测

采用Western Blot检测各组BDNF表达。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 成模率

手术组36只大鼠采用改良2-VO法造模后,3只死亡,3只不成模,有30只成模,成模率83.3%。

2.2 交通任督法对血管性痴呆模型大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的影响

模型组定位航行潜伏期较空白组及假手术组明显延长(P<0.05),空间搜索穿越次数明显少于空白组和假手术组(P<0.05),说明模型组学习记忆能力明显下降;针刺组、尼莫地平组定位航行潜伏期均明显短于模型组(P<0.05),空间搜索穿越次数均较模型组增加(P<0.05),针刺组、尼莫地平组定位航行潜伏期和空间搜索穿越次数比较,差异均无统计学意义(P>0.05),表明针刺和尼莫地平均可明显改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,两者作用相近。详见表1。

2.3 各组大鼠海马组织CA1区组织细胞形态学变化

HE染色结果显示,假手术组大鼠皮质和海马神经元细胞排列规则,结构完整,胞浆丰富,细胞核呈圆形、椭圆形,染色质在核内分布较均匀,核仁清晰,间质无水肿表现;模型组细胞排列紊乱,大量神经元变性,体积变小,胞核与胞浆界限不清,核固缩成三角形或不规则形,核仁消失,血管、神经元及神经胶质细胞周围间隙扩大;尼莫地平组、针刺组神经元细胞零星可见一些损伤细胞,海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常。表明针刺组和尼莫地平组均能保护海马CA1区的神经元细胞,减轻神经元细胞损伤。详见图1。

图1 各组海马组织CA1区组织细胞HE染色(×400)

2.4 各组BDNF蛋白表达比较

与模型组相比,假手术组、针刺组和尼莫地平组BDNF蛋白表达明显增多(P<0.05或P<0.01);与假手术组相比,针刺组与尼莫地平组BDNF蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);针刺组和尼莫地平组BDNF蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2、图3。

图2 各组BDNF蛋白表达条带图

图3 各组BDNF蛋白表达比较

3 讨 论

郭耀康教授在长期临床工作中创立了“交通任督法”的学术思想,是以任督二脉的风府、百会、人中、中脘、关元等穴位为主穴,施以一定的针刺手法,使阴阳脏腑、经络气血平衡而治愈疾病。郭耀康教授从事针灸临床工作50余年,认为人体疾病发生的根本为阴阳失调,正如《素问· 阴阳应象大论》曰:“阴阳者,天地之道也,万物之纲纪,变化之父母,生杀之本始,神明之府也”。而任督二脉为人体阴阳的总汇,两者一源而二歧,督脉则由会阴而行背,任脉则由会阴而行腹,最后交接于口周。督脉总督一身之阳,任脉总督一身之阴,任督二脉共同构成一个阴阳循环的体系,故任督二脉经气循环通畅,对于五脏六腑、十二经脉都起着重要作用[8]。

血管性痴呆属于中医“痴呆”的范畴,病位在脑,病机为髓海不足,气、火、痰、瘀内阻于脑。痴呆的发生与任督二脉密切相关,从循行分布上看,《难经·二十八难》记载:“督脉者……起于下极之腧,并于脊里,上至风府,入属于脑”“任脉者,起于中极之下,以上至毛际,循腹里……入目络舌”;又如《素问·骨空论》记载督脉的分支“上额交巅上,入络脑”“督脉、任脉和诸阳皆起于头”。从功能角度上看,脑位于颅内,为髓之海,其功能的发挥有赖于任脉的气血津液濡养;督脉则通髓达脑。因此,任督二脉对治疗脑部疾病有非常重要的意义,运用任督二脉的腧穴,可有效调整人体阴阳的平衡[9]。

交通任督法针刺处方中风府、百会、人中为督脉要穴,百会为诸阳经之会,内络于脑,风府为督脉入脑之处。《内经》云:“脑为髓海,其输在于盖(即百会),下在风府”,此二穴与脑髓密切相关,可疏通经络气血、调神益智、添精益髓。人中为督脉、手足阳明之会穴,对针刺感应强烈,具有疏通经络、醒神开窍的功效,可调节脑内气血的盛衰。有研究发现,百会尤擅改善血管性痴呆病人的记忆能力、计算能力,人中尤擅改善血管性痴呆病人的反应、嗜卧、恍惚等症状[10]。关元、中脘为任脉要穴。关元为先天之气海,为五脏六腑之本,有补肾益气、活血通络、培元固本之效;中脘是胃经之募穴,脾胃为后天之本,气血生化之源,能健脾和胃、扶正固本。《景岳全书·脾胃论》:“水谷之海,本赖先天为之主;而精血之海,又赖后天为之资”。关元、中脘同用,先天与后天相互资生,可补益气血津精、补脑充髓。诸穴共用,可疏通任督二脉经气、调和气血阴阳脏腑、调神益智,使气血精津充盛,髓海得以濡养,从而有效改善血管性痴呆的症状。

现代研究发现,血管性痴呆的发生常与海马的缺血改变密切相关,而海马是缺血损伤的敏感区域[11],直接参与信息储存和回忆,主要功能与学习记忆有关。在海马结构中,CA1区是与人类学习记忆功能关系最为密切的功能亚区,短暂、严重的全脑缺血引起的神经元迟发性死亡,多发生在海马CA1区的锥体细胞中,该区神经细胞的丢失可能导致严重的学习记忆障碍[12]。

随着科研人员对血管性痴呆发病机制的不断深入,神经营养因子在血管性痴呆发生发展过程中所起的作用越来越受到重视。BDNF属于神经营养因子家族的重要代表,主要由海马和大脑皮质的神经元产生,对神经元的分化、生长和生存起重要作用,可修复损伤的神经元[13-14],能调节突触可塑性,参与学习记忆过程,并可改善受损的学习、记忆能力[15-16]。有研究发现,短暂性或持续性脑组织缺血均可刺激内源性BDNF表达上升,具有内源性自我保护作用,促进受损神经元细胞修复,加速受损神经元细胞的分化及再生过程,并抑制细胞死亡[17]。还有研究发现,脑缺血缺氧后的动物反应和记忆均较差,脑组织中BDNF水平也明显降低,脑内注射BDNF可以在一定程度上改善动物的学习和记忆能力[18-19]。BDNF通过多种途径保护缺血缺氧细胞,实现其对缺损神经功能的恢复。

本研究结果显示,与模型组比较,针刺组定位航行潜伏期明显延长(P<0.05),空间搜索穿越次数明显增多(P<0.05);海马形态学方面,针刺组神经元细胞均可见零星损伤细胞,海马锥体细胞层细胞形态、排列基本正常,较模型组有明显改善;针刺组BDNF表达明显高于模型组(P<0.05),针刺组和尼莫地平组定位航行潜伏期、空间搜索穿越次数、海马形态学、BDNF表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。交通任督针刺法对血管性痴呆大鼠学习记忆能力有明显的改善作用,其机制可能是通过针刺提高海马CA1区BDNF表达来发挥神经保护作用。