花青素-3-葡萄糖苷干预过氧化氢诱导的H9c2细胞损伤的作用机制

袁晓丽,江 莉,黄莉莉,胡 斌

心血管疾病是一类发病率高、病亡率高、并发症多的严重疾病,由氧自由基过度合成引起的氧化应激,与心肌缺血再灌注损伤、心肌病、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生发展有关[1-2]。花青素-3-葡萄糖苷也称为矢车菊素-3-葡萄糖苷,是花青素的主要活性成分,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤等多种生物学功能[3-4]。据报道,花青素可通过抑制活性氧-c-Jun氨基末端激酶-B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)通路,减轻心肌缺血损伤[5]。但花青素-3-葡萄糖苷在过氧化氢(H2O2)诱导的心肌损伤中是否有保护作用还不清楚。鉴于此,本研究探讨花青素-3-葡萄糖苷干预H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤的作用机制,为该化合物的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

H9c2心肌细胞(中国科学院上海细胞库),花青素-3-葡萄糖苷(纯度>98%,武汉前衍化学科技有限公司),益气活血颗粒(弘美制药有限公司,国药准字Z20030092),噻唑蓝(MTT)粉末、RIPA裂解液、增强型化学发光试剂(ECL)盒、二氢乙锭(DHE)活性氧(ROS)荧光探针购自上海碧云天生物科技有限公司,Hoechst 33342荧光染料(美国MCE),V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(美国BD),β-actin鼠单克隆抗体、解偶联蛋白2(UCP2)、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及切割后半胱天冬酶3(Cleaved Caspase-3)兔多克隆抗体购自美国Cell Signaling,Trizol试剂(美国Ambion Life Technology),逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自美国Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 造模条件及给药浓度的筛选

取H9c2细胞接种于96孔板,于37 ℃的5%CO2增湿培养箱中培养过夜,分别加入0、100、200、300、400、500、600、700 μmol/L的H2O2处理4、8、12 h建立心肌细胞损伤模型,并设置对照组(加入不含H2O2的培养基),加入MTT溶液100 μL,继续培养4 h,弃上清后加入150 μL二甲基亚砜溶液,37 ℃震荡10 min,490 nm处检测吸光度值,计算细胞存活率(试验孔吸光度值/对照组吸光度值×100%)。取H9c2细胞接种于96孔板,过夜培养后,分别加入0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L花青素-3-葡萄糖苷,常规培养24 h,经MTT法观察细胞存活情况。

1.2.2 细胞分组

1)将H9c2细胞分为对照组、H2O2组、H2O2+益气活血颗粒组(1.5 mg/mL)及H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组,观察花青素-3-葡萄糖苷对H2O2诱导心肌细胞损伤的影响。2)将H9c2细胞分为NC组、短发夹RNA(shRNA)-1组、shRNA-2组、shRNA-3组,以UCP2为靶标的shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3及阴性对照物转入细胞,shRNA-1正向引物序列:5′-GGGATCCTGGAACGTAGTAAT-3′,反向引物序列:5′-ATTACTACGTTCCAGGATCCC-3′;shRNA-3正向引物序列:5′-TGGCCTCTACGACTCTGTAAA-3′,反向引物序列:5′-TTTACAGAGTCGTAGAGGCCA-3′;shRNA-3正向引物序列:5′-TGTGGTCAAGACGAGATATAT-3′,反向引物序列:5′-ATATATCTCGTCTTGACCACA-3′。采用实时荧光定量PCR检测UCP2 mRNA水平,筛选最优shRNA序列。3)将H9c2细胞分为对照组、H2O2组、H2O2+NC组、H2O2+shRNA-3组、H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组,观察UCP2在花青素-3-葡萄糖苷影响H2O2诱导心肌细胞损伤中的作用。

1.2.3 细胞凋亡检测

采用Hoechst 33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡。1)Hoechst 33342染色法:让玻片浸于细胞培养基内,取各组细胞爬片,滴加少量Hoechst 33342染料覆盖细胞,室温染色5 min,吸弃Hoechst 33342染料,并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次,封片后荧光显微镜下观察,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或破碎状致密浓染。2)流式细胞术:收集各组细胞,离心后加入PBS洗涤细胞,分别添加膜联蛋白V(AnnexinⅤ)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料、结合缓冲液,混匀培养15 min,再上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测UCP2 mRNA水平

收集各组细胞,用Trizol试剂提取细胞中RNA,经逆转录试剂盒合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,采用实时荧光定量PCR试剂盒对UCP2进行扩增。实时荧光定量PCR反应条件:95 ℃预变性2 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,共38个循环。UCP2正向引物序列:5′-GCACTGT- CGAAGCCTACAAGAC-3′,反向引物序列:5′-TGGCAT- TTCGGGCAACAT-3′。GAPDH正向引物序列:5′-TCAAG-AAGGTGGTGAAGCAG-3′,反向引物序列:5′-CCCTGT-TGCTGTAGCCAAAT-3′。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达

收集各组细胞,用RIPA裂解液提取总蛋白,测定蛋白浓度后,制备变性蛋白样品,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜后,取出聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸于5%脱脂牛奶中,室温封闭2 h,分别加入一抗β-actin鼠单克隆抗体(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、UCP2(1∶1 000)兔多克隆抗体,4 ℃冷藏过夜,再分别加入二抗牛抗鼠(1∶5 000)、牛抗兔(1∶1 000)IgG-HRP,37 ℃摇床孵育45 min,加入ECL发光试剂显影。应用Image J1.8.0软件检测蛋白条灰度值,以β-actin为内参,计算Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、UCP2相对表达量。

1.2.6 DHE染色检测ROS含量

将DHE ROS荧光探针以5 μmol/L浓度加入细胞中,37 ℃避光下培养30 min,荧光显微镜下观察DHE荧光情况。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 花青素-3-葡萄糖苷对H2O2诱导的H9c2细胞毒性及细胞形态的影响

随着H2O2浓度升高和作用时间延长,细胞存活率逐渐下降,呈现浓度和时间依赖性,综合考虑,选择对细胞损伤程度适中的H2O2600 μmol/L处理4 h建立心肌细胞损伤模型(见图1)。随着花青素-3-葡萄糖苷浓度升高,细胞存活率逐渐下降,呈现浓度依赖性(见图2)。与0 μmol/L比较,6.25～100.00 μmol/L浓度花青素-3-葡萄糖苷处理后细胞存活率无明显变化(P>0.05),而200 μmol/L时细胞存活率明显降低(P<0.05)。分别以6.25～100.00 μmol/L浓度花青素-3-葡萄糖苷处理心肌损伤细胞,50.00 μmol/L浓度的花青素-3-葡萄糖苷显示出对600 μmol/L的H2O2处理4 h引起的细胞毒性诱导的最高抑制作用,故选取无细胞毒性的50 μmol/L浓度为后续花青素-3-葡萄糖苷实验浓度。详见图3。形态学观察发现,对照组中的细胞似乎具有完整的包装膜、正常的纺锤形和圆形细胞核,而相比之下,在H2O2模型中,细胞表现出不完整的细胞膜、肿胀和退化的空泡。花青素-3-葡萄糖苷处理使细胞形态保持良好,细胞膜完整,细胞核圆整。详见图4。

图1 造模条件筛选

图2 花青素-3-葡萄糖苷给药浓度筛选

图3 花青素-3-葡萄糖苷对H2O2诱导H9c2细胞毒性的影响

图4 花青素-3-葡萄糖苷对H2O2诱导H9c2细胞形态的影响

2.2 花青素-3-葡萄糖苷对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较,H2O2组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表达明显升高(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组和H2O2+益气活血颗粒组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表达明显降低(P<0.05)。详见图5～图7。

图5 Hoechst 33342染色检测H9c2细胞凋亡

图6 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡

图7 各组H9c2细胞中凋亡相关蛋白表达比较

2.3 花青素-3-葡萄糖苷对H2O2刺激后H9c2细胞线粒体UCP2表达的影响

与对照组比较,H2O2组细胞中UCP2 mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组和H2O2+益气活血颗粒组UCP2 mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)。详见图8、图9。

图8 各组H9c2细胞中UCP2蛋白表达比较

图9 各组H9c2细胞中UCP2 mRNA表达比较

2.4 花青素-3-葡萄糖苷通过调节UCP2表达减轻心肌细胞凋亡

与NC组比较,shRNA-2组和shRNA-3组UCP2蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01),以shRNA-3组降低最为显著,以此为实验序列。与对照组比较,H2O2组和H2O2+NC组UCP2、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+shRNA-3组UCP2、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05);与H2O2+shRNA-3组比较,H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组和H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组UCP2、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见图10～图12。

图10 各组UCP2蛋白表达比较

图11 蛋白免疫印迹法检测UCP2及凋亡相关蛋白表达

图12 各组UCP2及凋亡相关蛋白表达比较

2.5 花青素-3-葡萄糖苷通过调节UCP2表达降低ROS含量

与对照组比较,H2O2组和H2O2+NC组ROS含量明显升高(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+shRNA-3组ROS含量明显升高(P<0.05);与H2O2+shRNA-3组比较,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷组、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷组和H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷组ROS含量明显降低(P<0.05)。详见图13、图14。

图13 DHE染色检测ROS含量

图14 各组细胞中ROS含量比较

3 讨 论

H9c2心肌细胞分离自大鼠,不仅其形态特征与原代心肌细胞相似,而且还保留了大鼠心肌细胞功能特征,是理想的心血管疾病模型载体[6]。H2O2是一种重要的ROS,可诱导细胞系或原代细胞的凋亡,在不同的研究中有不同的使用剂量[7-8]。本研究观察不同浓度和不同作用时间的H2O2对H9c2细胞存活的影响,结果显示,随着H2O2浓度升高、作用时间延长,细胞的存活率越低,表明H2O2对H9c2细胞的毒性具有时间、浓度依赖性,故选择对细胞损伤程度适中的600 μmol/L的H2O2处理4 h建立心肌细胞损伤模型。对花青素-3-葡萄糖苷给药浓度的筛选结果显示,6.25～100.00 μmol/L浓度花青素-3-葡萄糖苷处理后细胞存活率无明显变化,而200 μmol/L浓度花青素-3-葡萄糖苷处理后细胞存活率明显降低,为避免药物本身对细胞造成的损伤,同时保证药效,故选取无细胞毒性的50.00 μmol/L浓度为后续花青素-3-葡萄糖苷实验浓度。本研究结果显示,H9c2心肌细胞暴露于H2O2后,细胞凋亡率升高,给药后细胞凋亡率明显降低,提示花青素-3-葡萄糖苷可抑制细胞凋亡,对心肌细胞具有保护作用。Wu等[9]研究显示,花青素-3-葡萄糖苷对紫外线诱导的原代人真皮成纤维细胞形态学改变、氧化损伤和凋亡有明显的抑制作用。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子,根据功能可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白,正常细胞中Bax以单体形式分布于细胞质,当细胞凋亡信号激活时,会改变线粒体膜电位和通透性,诱导凋亡活性物质细胞色素C的释放[10]。Bcl-2作为典型的抗凋亡蛋白,主要分布于线粒体外膜,可结合Bax形成异源二聚体,阻止Bax的释放而发挥抗凋亡作用,同时,Bcl-2过表达还可介导氧化应激而保护细胞[11]。Caspase-3是细胞凋亡的执行者,可直接降解结构蛋白和功能蛋白,在线粒体途径的细胞凋亡中起关键作用[12]。Wei等[13]通过肾小管细胞HK-2的体外实验显示,花青素-3-葡萄糖苷可抑制ROS生成、细胞凋亡、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2,并增强线粒体释放细胞色素C的表达,保护汞诱导的糖尿病肾损伤。本研究中,经H2O2作用后细胞中Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达上升,花青素-3-葡萄糖苷处理后可逆转上述凋亡蛋白的表达,提示花青素-3-葡萄糖苷抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡,可能与下调Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达有关。

解偶联蛋白家族是线粒体内膜上的转运蛋白,可减少三磷酸腺苷(ATP)和ROS的产生,其中UCP2是研究最为广泛的成员[14]。细胞中ROS大多来自于线粒体电子传递链,其生成与质子跨膜势能密切相关[15]。UCP2可通过参与质子渗漏、降低质子势能,促进氧消耗,减少呼吸链电子传递,从而减少ROS的产生,保护机体的过氧化损伤[16]。本研究发现,H2O2诱导后细胞中UCP2表达明显降低,ROS含量明显升高;花青素-3-葡萄糖苷可通过提高UCP2表达,减少ROS,且这种作用可被靶向UCP2的shRNA所阻断。故推测花青素-3-葡萄糖苷的保护作用可能部分依赖于UCP2来抑制H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

综上所述,花青素-3-葡萄糖苷可能通过上调UCP2表达,降低Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达,清除ROS,从而发挥抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,从而发挥心肌细胞保护作用。