基于网络药理学探讨黄连有效成分治疗糖尿病性心肌病的作用机制

董丽妍,方红城,陈 洁,冼绍祥,李志芳,叶梦思,林剑华,黄小靖

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的并发症之一,以左心室扩张和肥大、心脏功能下降为特点[1],主要发病机制为代谢紊乱、微血管病变、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等[2],最终导致心力衰竭的发生,危及生命。现代医学诊治糖尿病性心肌病方面取得巨大进步,如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)等药物可用于逆转糖尿病性心肌病心室重构;注射用胰高血糖素样肽1类似物(GLP-1)可用于抑制心肌细胞凋亡,减少心肌受损[3-4]。由于西药具有副作用明显、不足以延缓或控制疾病发展等特点,西药诊治糖尿病性心肌病仍存在局限性。中医药具有多靶点、毒副作用少等诸多优势[5],在诊治糖尿病性心肌病方面可以弥补西药的不足,近年来备受关注。

古文献中未记载糖尿病性心肌病的病名,根据其症状可归属于中医学“消渴”“消瘅”“胸痹”等范畴。中医学认为,糖尿病性心肌病的发生多与先天禀赋不足,后天饮食不节、过劳纵欲、情志不畅等因素相关,阴虚燥热是其发病病机[6],中药黄连具有清热燥湿之效,故可用于治疗糖尿病性心肌病。古代医家多用黄连治疗消渴及其并发症。《名医别录》有云:黄连能够“止消渴”[7]。黄连排在《太平圣惠方》治疗消渴病常用药中的前3位。《普济方》中记载治疗消渴的黄连复方13个[8]。现代药理学亦表明,黄连具有降糖、改善胰岛素抵抗、抗炎、调脂、抗氧化等作用,用于治疗糖尿病性心肌病疗效显著[9-12],然而其作用机制仍有待进一步深入研究,故基于网络药理学探讨黄连治疗糖尿病性心肌病的作用机制具有重要意义[13]。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

主要数据库包括:中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),UniProt数据库(https://www.uniprot.org/),GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),OMIM数据库(https://omim.org/),STRING数据库 (https://string-db.org/cgi/input.pl),Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),G:profile数据库(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)和Cytoscape 3.7.1软件。

1.2 方法

1.2.1 筛选中药黄连化学成分和靶点

运用TCMSP数据库和PubChem数据库收集得到黄连的化学成分,根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及类药性(drug like,DL)≥0.18[14]选取中药黄连主要活性成分。

1.2.2 疾病靶点的获取

以“diabetic cardiomyopathy”为关键词,运用OMIM和GeneCards数据库进行检索,在GeneCards数据库中选择relevance score≥10的靶点,与OMIM数据库得到的靶点取交集,得到与糖尿病性心肌病相关的疾病靶点。

1.2.3 网络构建

将得到的黄连成分靶点与糖尿病性心肌病靶点交集,通过Cytoscape 3.7.1软件制作“疾病-药物-成分-靶点”网络图。

1.2.4 核心靶点筛选

运用STRING数据库导入交集靶点,选择“homo sapiens”物种,制作靶点的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图。

1.2.5 富集分析

根据DAVID数据库行基因本体(gene ontology,GO)生物过程富集分析结果绘制柱状图,根据京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析结果绘制气泡图。

2 结 果

2.1 黄连素成分收集及筛选

本研究通过TCMSP数据库平台,根据OB≥30%、DL≥0.18,检索并筛选中药黄连有效化学活性成分,共搜集到14个黄连符合的活性成分;将其通过PubChem数据库进行结果辨别,最后得到黄连有效成分10个(见表1)。通过UniProt数据库进行GeneSymbol转换,得到对应靶标88个。

表1 中药黄连有效活性成分

2.2 “疾病-药物-成分-靶点”网络构建和分析

以“diabetic cardiomyopathy”为关键词在GeneCards数据库搜索有关糖尿病性心肌病的基因,按照relevance score≥10,与在OMIM数据库获取的靶点取交集,提取靶点856个,将相关靶点信息录入UniProt数据库中检索,选择人源靶点,最终获得疾病靶点786个。运用Venny 2.1在线数据库取交集,绘制88个黄连生物碱化合物靶点与786个糖尿病性心肌病相关疾病靶点基因韦恩图,得到70个交集靶点基因,可能是黄连治疗糖尿病性心肌病的关键靶点(见图1)。通过Cytoscape 3.7.1软件构建糖尿病性心肌病与黄连相关“疾病-药物-成分-靶点”网络(见图2)。网络中共有82个节点(其中疾病靶点1个,药物靶点1个,药物化合物节点10个,靶基因节点70个)和186条连接边。其中红色六边形代表疾病(糖尿病性心肌病),黄色圆形代表中药(黄连),绿色箭头代表黄连有效成分,蓝色三角形代表疾病与药物有效成分相关的作用靶点。其中连接度越大,则节点形状越大,提示节点在网络中的位置越重要。对“疾病-药物-成分-靶点”网络进行拓扑分析,连接度排在前3位的活性成分为槲皮素、小檗碱及巴马汀,提示该3种活性成分是整个网络的关键,可能是黄连治疗糖尿病性心肌病的主要化合物。

图1 糖尿病性心肌病-黄连相关靶点基因韦恩图

图2 糖尿病性心肌病-黄连药物活性成分-作用靶点网络图

2.3 黄连有效成分作用靶点PPI 网络的构建及关键靶点聚类

已有研究表明,网络中蛋白的度值(Degree)越大,其重要性越大。对黄连及糖尿病性心肌病的交集靶点网络进行拓扑分析,选取度值排名前20位的靶点(见表2)。黄连有效成分作用靶点的PPI网络如图3所示。通过“MCODE”插件行聚类分析PPI网络,最终产生4个子网络。子网络1得分为4.571分,有5个节点、9条边,包含的节点有原癌基因(MYC)、B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子α(NFKBIA)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARA)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1和一氧化氮合酶2(NOS2);子网络2得分为3.000分,有4个节点、6条边,包含节点趋化因子配体2(CCL2)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、白细胞介素8(CXCL8/IL-8)和白细胞介素10(IL-10);子网络3得分为3.000分,有8个节点、10条边,包含节点基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-2、胰岛素样生长因子2(IGF2)、血管内皮生长因子 A (VEGFA)、表皮生长因子受体(EGFR)、牛蛋白激酶Cβ1(PRKCB)、人蛋白激酶(PRKCA)和嗜中性粒细胞胞浆因子1(NCF1);子网络4得分为3.000分,有3个节点、3条边,包含节点血红素氧合酶1(HMOX1)、核因子红细胞2相关因子2(NFE2L2)和FOS。详见图4。

图3 黄连有效成分作用靶点PPI网络

图4 聚类分析子网络

表2 黄连对糖尿病性心肌病作用靶点的拓扑学分析(连接度排名前20位)

2.4 靶点生物学功能分析及GO功能富集分析

对糖尿病性心肌病-黄连有效成分交集的70个靶点进行GO分析,GO分析包括分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)及细胞组分(cellular component,CC)3个部分。将70个靶点导入g:Profile数据库进行GO分析,在MF、BP、CC中分别选择P<0.05且P最小的前10条路径(P值越小,则通路越关键),运用Excel制作条形图(见图5)。其中,MF富集的前10条通路包括:酶结合(enzyme binding)、信号受体结合(signaling receptor binding)、相同的蛋白结合(identical protein binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、一氧化氮合酶调节剂活性(nitric-oxide synthase regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、核受体活性(nuclear receptor activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、配体激活的转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)。BP富集的前10条通路包括:细胞对化学刺激的反应(cellular response to chemical stimulus)、化学反应(response to chemical)、对含氧化合物的反应(response to oxygen-containing compound)、对有机物质的反应(response to organic substance)、细胞对有机物质的反应(cellular response to organic substance)、细胞对含氧化合物的反应(cellular response to oxygen-containing compound)、细胞表面受体信号通路(cell surface receptor signaling pathway)、细胞过程的正调控(positive regulation of cellular process)、对刺激反应的调节(regulation of response to stimulus)、生物过程的正向调节(positive regulation of biological process)。CC富集的前10条通路包括:膜小凹(caveola)、细胞外间隙(extracellular space)、细胞器内腔(organelle lumen)、微管确定膜性细胞腔(membrane-enclosed lumen)、胞膜外区(extracellular region)、质膜筏(plasma membrane raft)、膜筏(membrane raft)、膜质微区(membrane microdomain)、质膜蛋白复合物(plasma membrane protein complex)、质膜的内在成分(intrinsic component of plasma membrane)。

图5 黄连靶向糖尿病性心肌病网络靶点的GO分析

选取经R语言运行后得到的前20个功能的GO功能富集分析结果(共99个),绘制柱状图见图6。其中,富集最多的通路包含13个靶基因,包括:细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)、信号受体配体活性(signaling receptor ligand activity)等。

图6 黄连-糖尿病性心肌病作用靶点GO富集柱状图

2.5 靶点通路分析

通过KEGG通路富集分析黄连治疗糖尿病性心肌病的可能机制及途径。KEGG分析获得153条通路,其中128条有统计学意义(P<0.01)。P-adjust数值越小,提示显著性越大,由低到高选取排名前20名制作气泡图(见图7)。图中排序越靠前,表明其通路作用影响越大。KEGG通路富集分析主要富集在糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切力及动脉硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、蛋白聚糖在癌症(proteoglycans in cancer)、甲型流感(influenza A)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、白细胞介素17(IL-17)信号通路(IL-17 signaling pathway)、美洲锥虫病(Chagas disease)、丙型肝炎(hepatitis C)、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、膀胱癌(bladder cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、利什曼病(Leishmaniasis)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、疟疾(malaria)、非洲锥虫病(African trypanosomiasis)。

图7 KEGG富集分析气泡图

3 讨 论

研究表明,糖尿病性心肌病的发病机制与代谢异常、线粒体功能障碍、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活、氧化应激、自噬、炎症和心脏微血管功能障碍等相关[15]。现代医学在诊治糖尿病性心肌病方面取得重要进展,然而,仍然存在副作用多、不足以延缓疾病进展等局限,中医药治疗糖尿病性心肌病疗效显著,能弥补西药的不足,相辅相成。中药具有多靶点、多作用途径,在治疗糖尿病性心肌病方面疗效确切,目前关于中药单味药或复方作用于糖尿病性心肌病的机制研究已成为热点,具有广阔的应用前景[16]。

本研究主要通过网络药理学分析黄连治疗糖尿病性心肌病的潜在作用机制。在活性成分研究中,共筛选出黄连的有效成分10个,其中,槲皮素、小檗碱及巴马汀位居前3位,提示该3种成分是整个网络的关键,可能是黄连发挥疗效治疗糖尿病性心肌病的主要化合物。槲皮素广泛存在于多种中药中,能够抗炎、抗病毒、抗癌及治疗糖尿病及其并发症[17]。研究发现,槲皮素可通过防止三磷酸腺苷(ATP)水平降低和过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因子1(PGC-1)、线粒体解偶联蛋白2(UCP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)表达的改变,改善氧化应激状态,达到减少心肌纤维化、肥大的作用,能够用于防治糖尿病性心肌病引起的心肌细胞受损[18-21]。黄连的另一个主要有效成分小檗碱又名黄连素[22],可抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和心肌细胞肥大,减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子β1(TGF-β1)含量,提高一氧化氮(NO)水平,进而改善心脏结构。另外,小檗碱可影响糖脂代谢途径中关键酶的含量,调节PPARα、PPARγ和第四型葡萄糖转运蛋白(GLUT4)的基因和蛋白表达,增加心肌脂肪的降解与转运及葡萄糖降解,进而降低心肌游离脂肪酸含量,减轻其对心脏的损害。巴马汀则以抗感染作用为主[23]。

核心靶点分析中,根据PPI网络聚类分析的4个子网络,子网络1中MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1和NOS2靶点主要涉及炎症、脂质代谢、细胞外信号调节、氧化应激等;子网络2中CCL2、ICAM1、CXCL8(IL-8)和IL-10主要涉及炎症反应、免疫调节;子网络3中MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1主要涉及炎症、氧化应激、细胞分化增殖、血管内皮增生、细胞黏附、细胞凋亡等有关;子网络4中HMOX1、NFE2L2和FOS与细胞增殖、分化和转化及细胞凋亡有关。结合GO富集分析结果,提示黄连可能通过细胞周期调节、细胞凋亡、改善微血管病变、调节代谢、抗炎、氧化应激等途径发挥治疗糖尿病性心肌病的作用。

在KEGG通路富集分析方面,排除与癌症、病毒相关的通路,黄连主要成分靶点主要富集在糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路、流体剪切力及动脉硬化、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路和PI3K-AKT信号通路。本研究结果显示,糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路是通路富集结果中显著性最高的通路,AGE-RAGE能够激活核转录因子-κB(NF-κB),通过IL-6、TNF-α等炎性因子、生长因子及黏附因子等,导致炎症反应及细胞黏附反应,这是糖尿病性心肌病发生的主要机制之一[24]。同时,研究表明,流体剪切力及动脉粥样硬化通路在改善胰岛素抵抗、抗炎、抑制细胞凋亡等方面对糖尿病性心肌病有影响[25-26]。当机体发生缺血缺氧时,HIF-1作为触发各种应激蛋白表达的主要转录因子[27],其减少可导致心肌肥厚[28]。HIF-1在心肌中高表达,其靶基因VEGF等可能参与保护心肌,从而达到减轻糖尿病小鼠心肌重构的目的[29-30]。TNF信号通路具有多效生物学效应,研究表明,黄连素能阻止TNF-α诱导血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA增高,减弱细胞黏附作用[31]。同时,黄连素可通过增加脂联素蛋白分泌,减少瘦素、TNF-α和IL-6等水平来改善胰岛素抵抗[32],发挥调节代谢的作用。IL-17是糖尿病病人发生炎症反应的重要炎性因子之一,能够启动p38MAPK、P13K/AKT/细胞外调节蛋白激酶(ERK)等一系列炎性因子通路,发生炎症反应[33]。近年来研究发现,松弛素信号通路除了与分娩有关,还与减少氧化应激损伤、保护高糖诱发心肌肥厚及细胞凋亡相关[34]。PI3K-AKT信号通路具有调节葡萄糖摄取、糖原合成与糖原合成激酶失活等作用[35],是胰岛素发挥作用的关键通路,参与细胞凋亡、血管生成、端粒酶活性及抗炎等过程[36],对糖尿病性心肌病的诊治具有重要意义。

综上所述,黄连治疗糖尿病性心肌病的可能机制:黄连中的槲皮素、小檗碱及巴马汀等主要活性成分作用于糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路、流体剪切力及动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路及PI3K-AKT信号通路等,以MYC、NFKBIA、PPARA、MAPK1、NOS2、CCL2、ICAM1、CXCL和IL-10、MMP-1、MMP-2、IGF2、VEGFA、EGFR、PRKCB、PRKCA和NCF1、HMOX1、NFE2L2和FOS等为关键靶点,通过调节代谢、改善微血管病变、抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡等作用机制来治疗糖尿病性心肌病。由此可知,黄连治疗糖尿病性心肌病是多成分、多靶点、多通路相互作用的结果。接下来,本团队将通过基础研究、临床研究等途径进一步验证。