混合盲样菌株鉴定过程分析与体会

王飞 陈燕 徐亚仙

作者单位：311600 浙江建德，建德市疾病预防控制中心（王飞）

311600 浙江建德，建德市新安江街道社区卫生服务中心（陈燕）

322000 浙江义乌，浙江大学医学院附属第四医院（徐亚仙）

为提高临床实验室细菌鉴定技术水平，加强检验人员的基本功训练和知识更新，全面提升检测能力，建德市疾病预防控制中心检验科于2021 年5 月参加上级部门组织的能力验证活动，从下发的半固体穿刺培养物中检出福氏志贺菌2a 型和肠道产毒性大肠埃希菌，结果满意，现报告如下。

1 材料与方法

1.1待检样品 半固体菌株培养物一支。

1.2培养基及试剂 营养琼脂、沙门菌-志贺菌（SS）琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、沙门菌显色培养基、大肠埃希菌（ECC）显色培养基、志贺菌显色培养基、弧菌显色培养基、厌氧产气袋均由广东环凯微生物科技有限公司提供，革兰阴性细菌鉴定卡由法国生物梅里埃公司提供，快速革兰染色液由广东珠海贝索生物技术有限公司提供，以上试剂和培养基均经标准菌株验证合格，并在有效期内使用。

1.3诊断血清 志贺菌属诊断血清（48 种）由兰州生物制品研究所提供（批号20200101，有效期至2022 年2 月1 日）；志贺菌免疫血清2 号套装（19 种）由日本生研株式会社提供（批号508096，有效期至2021 年9 月）。

1.4PCR 检测试剂 5 种致泻大肠埃希菌核酸多重实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reacton，PCR）检测试剂盒（包含11 种毒力基因）由卓诚惠生生物科技股份有限公司提供（批号：T202105072，有效期至2022 年5 月24 日）。

1.5仪器 VITEK2 COMPACT15 微生物鉴定与药敏分析系统由法国生物梅里埃公司制造，ABI7500型实时荧光定量PCR 仪由美国ABI 公司制造，以上仪器均经检定合格后使用。

1.6研究方法

1.6.1常规培养 依据《国家致病菌识别网技术规范》以及盲样检测作业指导书进行操作，包含28 种革兰阴性（Gram negative，G-）和革兰阳性（Gram positive，G+）目标菌的检测标准作业程序（standard operating procedure，SOP）。

1.6.2细菌核酸提取 挑取半固体培养物于5 mL营养肉汤中，（36±1） ℃培养6 h，吸取1 mL 菌悬液至1.5 mL 无菌离心管，以13 000 r/min 离心2 min 后弃上清，在沉淀中加入100 μL 核酸抽提液，将沉淀悬浮后于100 ℃加热10 min；以13 000 r/min 离心5 min，取上清液进行PCR 检测。

1.6.3PCR 反应 参照试剂盒说明书进行。

2 检测过程

2.1观察 获得盲样后，经初步观察发现半固体培养物有2 根穿刺线，疑似混合菌株盲样。

2.2快速革兰染色镜检 挑取半固体培养物进行革兰染色，镜检结果均为G-杆菌，无芽孢，无荚膜。

2.3分离培养 按照相关SOP，从原始半固体培养物划线接种至SS 平板、麦康凯平板、沙门菌显色平板、ECC 显色平板、志贺菌显色平板、弧菌显色平板以及血平板，于（36±1） ℃培养24 h。

2.4观察各平板菌落生长情况 ①SS 平板：粉红色、中等大小、圆形光滑凸起、边缘整齐，疑似纯培养。② 麦康凯平板：粉红色、中等大小、圆形光滑扁平、边缘整齐，疑似纯培养。③ 沙门菌显色平板：蓝色、圆形较小、稍凸起、边缘整齐，疑似纯培养。④ ECC 显色培养基：蓝色、无色带蓝点，2 种菌落生长。⑤ 志贺菌显色平板：黄色、周围培养基变黄、中等大小菌落，疑似纯培养。⑥ 弧菌显色平板：生长被抑制。⑦ 血平板：中等大小、白色凸起、湿润、边缘整齐、不溶血菌落生长，疑似纯培养。

2.5分纯 从上述培养基上分别挑选单个菌落划线至普通平板进行纯培养，36 ℃培养24 h。

2.6初步鉴定 从分纯过的普通平板上挑取菌落进行革兰染色镜检、氧化酶试验、氧化-发酵试验及动力试验，结果分别为G-杆菌、氧化酶阴性、发酵型、动力阳性，考虑为肠杆菌科细菌。将以上菌落分别接种于三糖铁琼脂斜面，结果均为斜面产酸，底层产酸产气。

2.7全面生化试验 从普通平板上将纯培养的菌落使用无菌生理盐水配制成0.50～0.63 麦氏单位的菌悬液，经全自动微生物分析系统鉴定，均为大肠埃希菌，置信概率为99%。至此，笔者考虑待检盲样是否为2 种致病性大肠埃希菌（即ECC 显色培养基上两种形态的菌落）的可能性。

2.8毒力基因检测 对已经鉴定为大肠埃希菌的菌株（包括CHROMagar 大肠菌群大肠埃希菌ECC显色培养基上两种形态的菌落），同时进行5 种致泻性大肠埃希菌的毒力基因检测，结果均为肠产毒素性大肠埃希菌。至此，盲样中包含两种致病性大肠埃希菌的判断被否定。见图1。

图1 5 种致泻性大肠埃希菌毒力基因检测图谱

2.9调整思路 由于大肠埃希菌对营养及培养条件要求不高，属于常见的优势菌范畴，考虑是否有另一种G-菌生长受到大肠埃希菌抑制的可能。笔者通过查阅文献得知，虽然大肠埃希菌为兼性厌氧菌，但在厌氧环境中其生长速度会大大减缓［1］，于是又从原始半固体培养物重新划线接种至SS 平板和血平板（考虑是否为肠杆菌科之外的细菌），36 ℃厌氧培养24 h。结果可见，SS 平板除红色菌落外出现少许无色半透明菌落，血平板除之前分离到的中等大小白色菌落外还出现了灰白色较小不溶血菌落。

对SS 平板上的无色半透明菌落以及血平板上的灰白色较小菌落进行进一步鉴定，经普通平板分纯后进行革兰染色镜检、氧化酶、氧化-发酵试验、动力试验，结果分别为G-杆菌、氧化酶阴性、发酵型菌、动力阴性，初步判定为肠杆菌科细菌，经全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定，该菌为志贺菌群，置信概率为99%。

2.10血清凝集

2.10.1本中心兰州生物所志贺菌属诊断血清（48 种）凝集结果 生理盐水不凝集（-）；志贺菌属四种多价凝集（++++），福氏多价凝集（+++），福氏Ⅰ型凝集（+++），福氏Ⅱ型凝集（+++），群3、4 凝集（+++），群6 不凝集（-），群7 凝集（+++）。该凝集结果不合理，笔者认为兰州生物所批号为20200101的志贺菌诊断血清有质量问题。

2.10.2日本生研血清凝集结果 经兄弟单位提供的日本生研株式会社DENKA 生产的志贺菌免疫血清2 号套装（19 种）凝集，结果为福氏Ⅰ型不凝集（-），福氏Ⅱ型凝集（+++），群3、4 凝集（+++），群6不凝集（-），群7 不凝集（-）。根据该血清学试验结果，认为本菌符合福氏志贺菌2a 血清型特征。

3 检测结果

综合以上结果，报告盲样菌株检出福氏志贺菌2a 型和肠道产毒性大肠埃希菌（ETEC）。后经上级部门下文证实，检测结果正确无误。

4 讨论

盲样菌株微生物室间考核评定的主要目的是验证实验室对细菌鉴定的能力，也是计量认证和国家实验室认可的特定要求［2-5］。混合菌盲样考核对检验人员的思维与技术要求较高，要综合考虑影响细菌生长的诸多因素（如对气体和营养的要求以及培养温度等）。本研究若按照常规思路进行需氧培养，则很容易导致非优势菌被漏检，采用厌氧培养条件即成功分离出第2 种菌（志贺菌），这也与食品中志贺菌检测国家标准GB 4789.5-2012［6］中需要厌氧培养的要求一致。

志贺菌混合致病性大肠埃希菌，致病性大肠埃希菌为绝对优势菌。根据曾莹春等［7］研究结果显示，大肠埃希菌与志贺菌一同培养时，会抑制志贺菌生长，且随着时间的推移，抑制现象越来越明显，而志贺菌也可以被认为是新陈代谢不活跃的大肠生物群［8-9］。后经了解，本研究盲样考核从发样单位进行半固体穿刺到笔者初次分离已经间隔4 d，此时志贺菌已被明显抑制。因此，微生物菌株鉴定盲样对检测时限性要求很高，尤其是混合菌株盲样一定要在第一时间进行分离，以免劣势菌被优势菌覆盖导致漏检。另外，某些型别的志贺氏菌菌株与大肠埃希氏菌不仅在生化反应上很难区分，甚至和大肠埃希菌含有共同抗原［10］，这给考核工作带来了困难，也需要更多检测手段如毒力基因检测来确保检测结果的准确性。

良好的实验室内部质控是做好菌株盲样鉴定的重要保证［11-12］，特别是试剂、培养基、诊断血清都要使用已知标准菌株进行质量鉴定。但试剂质量鉴定工作任重道远，本研究所用培养基均经标准菌株验证合格后使用，但诊断血清的验证因基层实验室保存的标准菌株品种有限，无法做到全覆盖，造成了质量问题出现。因此，建议有条件的实验室多收集一些标准菌株，对诊断血清进行验证时尽量做全；同时，必要时也可以多准备几个厂家的诊断血清，在凝集遇到问题时候可供参考。

显色培养基可以快速对目标菌种进行筛选，目标菌种往往呈现出特定的菌落特征，但在实际分离过程中也允许少量不典型菌落存在［13］，因此对显色培养基上的菌落不能一味地凭表象而要综合生化特征进行判断。本研究中ECC 显色培养基中致病性大肠埃希菌就有深蓝、无色中央带蓝点两种菌落特征，造成笔者在鉴定过程中走了弯路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突