反转录酶在微小RNA 实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

付瑶 刘海婷 施俊超 栾天 文静 张俊 张大军

作者单位：110000 辽宁沈阳，沈阳医学院药学院

实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，是检测各种类型病原微生物的常用方法，也常用于基因检测［1-2］。目前广泛采用RT-qPCR 作为新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）检测的首选方法［3-4］。但是在RT-qPCR 的应用中也存在因其敏感度高导致结果容易出现假阳性，且因检测样本极易受到污染，从而造成检测结果不准确的问题，特别是针对片段长度较短的DNA 和RNA 样本，容易出现假阳性或假阴性结果。

微小RNA（micro RNA，miRNA）作为一类内源性的、长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，可通过几个miRNA 的组合来精细调控某个基因的表达。miRNA 有多种存在形式，能够在组织样本和无细胞生物液体（如血清或血浆）中被检测到，且已被证明会影响多种重要的生物学过程，如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育和细胞凋亡［5］。本研究拟选择miR-132 和miR-U6 作为检测对象，分析影响RT-qPCR 实验结果的关键点，并筛选最优检测方法，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.13 种miRNA 提取方法 提取方法1：使用Easy Pure®miRNA 提取试剂盒（由北京全式金生物公司提供）；提取方法2：使用miRNA 提取试剂盒（由德国QIAGEN 生物公司提供）；提取方法3：使用Trans Zol Up Plus RNA 提取试剂盒（由北京全式金生物公司提供）。

1.1.23 种反转录方法 反转录方法1：使用Trans Script®第一链cDNA 反转录试剂盒（北京全式金生物公司）；反转录方法2：使用Evo M-MLV 反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；反转录方法3：使用miRNA 第一链cDNA 合成试剂盒（美国GeneCopoeia 公司）。

1.1.3其他仪器与试剂 使用超微量紫外可见分光光度计〔购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕检测miRNA 和cDNA 浓度与纯度，使用Light Cycler 480 实时定量PCR 仪（购自德国罗氏公司）通过常规RT-qPCR 检测miRNA 含量。引物为All-in-One TM miRNA qPCR引物（购自美国GeneCopoeia公司）；RT-qPCR 试剂盒为All-in-One TM miRNA qPCR 检测试剂盒2.0，购自美国GeneCopoeia 公司。

1.2研究方法

1.2.1miRNA 提取方法 总体步骤：① 取100 mg组织，加入1 mL 裂解液,混匀后于室温静置5 min；② 每使用1 mL 裂解液加入200 μL 氯仿剧烈振荡30 s 后，室温孵育3 min；③ 以≥10 000×g于4 ℃离心15 min，转移上层无色水相于新的1.5 mL 无酶EP 管中，加入无水乙醇，颠倒混匀；④ 将溶液和沉淀全部转移，加入离心柱中，12 000×g离心30 s，弃去收集管中的液体；⑤ 加入洗脱液Ⅰ，12 000 ×g离心30 s，弃去收集管中的液体，重复此步骤1 次；⑥ 加入洗脱液Ⅱ，12 000×g离心30 s，弃去收集管中的液体，重复该步骤1 次；⑦ 于室温下12 000×g离心2 min，彻底去除残留乙醇；⑧ 将离心柱放入1.5 mL 无酶离心管中，在离心柱中央加入30～50 μL双蒸水，室温静置1 min；⑨ 12 000×g 离心1 min，洗脱miRNA，-80 ℃冰箱保存；⑩ 测定miRNA 的浓度及不同波长下的吸光度（A230、A260、A280）值。详细方法请参照试剂盒公司官网。

1.2.2反转录方法 方法1：使用Trans Script®第一链cDNA 反转录试剂盒，依次加入4 μL 的5×Trans Script®qPCR 第一链混合液、1 μL 的基因DNA（gene DNA，gDNA）去除试剂、0.1 ng～1 μg 的miRNA，并加入双蒸水补足体积至20 μL。反转录反应条件为42 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，于4 ℃保存。

方法2：使用Evo M-MLV 反转录试剂盒，第一步依次加入2 μL 的5×gDNA 缓冲液、1 μL 的gDNA洗涤液、1 μg 的总RNA，并加入双蒸水补足体积至10 μL，42 ℃反应2 min。第二步依次加入10 μL上一步反应液、1 μL 的Evo-M-MLVRTase 混合酶、1 μL 的Oligo dT（18T）引物（50 μmol/L）、1 μL 的随机6 mers 引物（100 μmol/L）、4 μL 的5×反转录酶反应缓冲液混合物Ⅰ、3 μL 双蒸水，随后37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，4 ℃保存。

第三，教学方法和手段。目前国内高校主要以课堂讲授式的教学方法为主，辅以一定的实践教学手段完成教学。近十年来，在教育部的倡导下，国内大部分新闻传播院系都建起了大小不同、先进程度各异的新闻传播实验室，以传统媒体业务流程为蓝本对实践教学资源进行配置，设置相应的课程。

方法3：使用miRNA 第一链cDNA 合成试剂盒，依次加入0.1 ng～1 μg 的miRNA、1 μL 的2 U/μL 多聚A 尾聚合酶、1 μL 的Sure Scirpt TM 反转录酶混合液（20×）、4 μL 的5×PAP/RT 缓冲液，并加入双蒸水，补足体积至20 μL。反转录反应条件为37 ℃反应60 min，85 ℃反应5 min，4 ℃保存。

最后，测量总cDNA 的浓度及A230、A260、A280值，分装保存于-20 ℃冰箱里。

1.2.3RT-qPCR 方法 经反转录过程得到的cDNA可以直接进行RT-qPCR 分析，本研究采用荧光实时定量PCR 试剂盒进行RT-qPCR 反应,各反应体系见表1。根据以下反应条件进行实时荧光定量PCR，各反应条件见表2。

表1 RT-qPCR 反应体系

表2 RT-qPCR 扩增程序

1.3统计学分析 所有数据均使用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 23.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miRNA 提取 与DNA 相比，RNA 极其容易被分解，这主要由于RNA 自身的不稳定性以及RNase的存在。因此，需要检测RNA 浓度来确定其质量是否符合要求。此外，除了RNA 浓度，A260/A280和A260/A230也可以反映RNA 的纯度：当A260/A280处于1.9～2.1，则表示RNA 纯度较高；A260/A280＜1.9 提示可能有蛋白杂质残留，A260/A280＞2.1 则提示RNA 可能存在降解。A260/A230在2.0 左右表示RNA 无污染，A260/A230值越小则越可能存在盐离子残留。因此，相较于方法1 和方法3，方法2 的样本miRNA 浓度和纯度均更高。见表3，图1。

图1 3 种miRNA 提取方法的样本吸光度值

表3 3 种提取方法的miRNA 浓度测定结果

2.2miRNA 反转录 使用3 种方法提取miRNA 后，将3 个miRNA 样本分别采用3 种方法进行反转录，同时检测cDNA 浓度、A260，计算A260/A280、A260/A230。结果显示，方法3 的反转录效果更好。但反转录后的产物是一个混合体系，存在cDNA、未完全反转录的RNA、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、各种蛋白和盐离子等成分，会干扰cDNA 的吸光度。因此，要确定哪种方法效果更好，主要取决于RT-qPCR 实验结果。见表4，图2。

图2 三种cDNA 样本吸光度值

表4 三种反转录方法的cDNA 浓度测定结果

图3 不同miRNA 提取方法在RT-qPCR 检测中的Ct 值

图4 不同miRNA 反转录方法在RT-qPCR 检测中的Ct 值

表5 不同miRNA 提取方法在RT-qPCR检测中的Ct 值（x±s）

表6 不同miRNA 反转录方法在RT-qPCR检测中的Ct 值（x±s）

3 讨论

RT-qPCR 可基于分子技术来检测在基因表达中目标mRNA 的相对定量，也是检测miRNA 的常用的方法之一。RT-qPCR 具有较高的敏感度和特异度，广泛应用于病原微生物的快速检测。这些特性使它成为在临床样本中快速检测具有大流行潜力的致命病原体（如SARS-CoV-2）的最佳选择［6］。但使用常规的RT-qPCR 方法检测序列较短的目的片段是有挑战性的。

miRNA 的长度通常只有21～23 个碱基对，对于RT-qPCR 来说，mRNA 到cDNA 的反转录可以产生显著的可变性，其中同一样本的结果可以相差2～3 倍，这取决于RT-qPCR 反应中使用mRNA 的浓度和纯度［1，7］。同样，使用普通的mRNA 反转录方法无法得到足量cDNA，因此miRNA 的反转录要求将miRNA 序列进行延长，可以使用到的延长方法包括茎环法和加尾法；且传统的PCR 引物长度约为20 个碱基对，因此在设计PCR 引物的技术上具有挑战性［8］。同时，使用特异性模板的qPCR 通常会比单核苷酸差异的模板增加10～100 倍的扩增信号，但使用PCR 区分仅相差1～2 个核苷酸的miRNA 仍然是一个挑战［9］。

本研究表明，使用不同的miRNA 提取方法得到的RT-qPCR 结果比较差异无统计学意义，但可从miRNA 的效率和质量判断出提取方法2 效果更好；使用不同反转录方法得到的RT-qPCR 结果比较差异有统计学意义。

与传统的基于RT-qPCR 技术分析蛋白编码基因mRNA 表达的方法相比，检测miRNA 的表达水平具有特殊性和挑战性。首先，传统的RT-qPCR 检测核苷酸序列较短的miRNA 更加困难。其次，RTqPCR 对于检测的表达水平差异很大（从每个细胞只有少量到＞100 000 个拷贝不等）的miRNA 是有挑战的。最后，miRNA 不仅长度短，且序列相似，这也增加了RT-qPCR 检测的难度。因此，许多可用的方法都利用了特殊的反转录操作步骤，以促进PCR扩增及其鉴定，如在反转录阶段通过茎环引物法或加尾法延长cDNA 的长度，以满足上、下游引物、荧光探针等与cDNA 互补结合的需求，保证后续的RT-qPCR 过程［10-11］。因此，针对miRNA 或其他序列较短的RNA，在反转录步骤中采用特殊的反转录酶是有必要的。

近年来，miRNA 也在不同领域研究中广泛得到应用，在机体的不同组织或同一组织的不同发育阶段及多种癌症组织中，miRNA 表达具有一定的差异性，如miR-132 在神经系统疾病［12］、精神疾病［13］、免疫系统疾病［14］以及癌症［15］中都发挥着不同的调节作用。因此，后续研究可以针对不同种类样本进行分析，以便更好发现miRNA 的表达差异情况。

综上所述，本研究考察了不同miRNA 提取方法和不同反转录方法对RT-qPCR 结果的影响，筛选出最佳方法，同时对miRNA 在临床应用研究中的检测提供了重要参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突