免疫分析仪检测血栓四项的性能验证

王莹莹 郑双林 谢华斌

作者单位：361000 福建厦门，厦门大学附属心血管病医院检验科，厦门市心血管疾病精准医学重点实验室

血栓性疾病是全世界范围内导致患者死亡的重要因素之一。在检验筛查项目中，除了已有的凝血基础筛查检测项目外，目前新兴的血栓四项检测正逐渐进入人们的视野，血栓四项主要检测项目包括血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）、组织纤溶酶原激活物-抑制物1复合物（tissue plasmin activator inhibitor 1 complex，tPAIC）和纤溶酶-抗纤溶酶复合物（plasmin antiplasmin complex，PIC），上述四项检测标志物将预测血栓性风险的关口前移，能够在早于血栓发生之前预测其存在。

目前最早检测血栓四项的仪器为日本希森美康株式会社HISCL-5000 电化学发光检测分析仪，但因进口设备和试剂价格高，所以成本高昂，很多中小型医院对血栓四项检测只能望而却步。本研究通过对国全自动化学发光免疫分析仪检测血栓四项进行性能验证，为该检测在全国各级医疗机构的开展提供一种新的选择，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1仪器和试剂 万孚FC-302 化学发光免疫分析仪及血栓四项配套检测试剂、定标品、质控品均由广州万孚生物技术有限公司提供。

1.2标本收集 收集本院2021 年7 月1—30 日健康体检者的新鲜血液标本，避免有出现乳糜、脂血、溶血、黄疸等不合格现象的标本，且血细胞比容＜55%。使用0.109 mmol/L 浓度的枸橼酸钠抗凝剂采血管采集样本，参照临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H21-A5 文件［1］中，对于抗凝血浆的处理标准操作规程进行处理，并以1 500g离心10 min。

1.3性能验证方法

1.3.1精密度验证 ① 批内精密度：参照CLSI 制订的EP15-A 文件［2］标准操作要求，分别对万孚原厂血栓四项配套质控品进行检测，该质控品每个项目有两个不同的浓度水平，每个水平质控品连续检测20 次。记录结果后，计算各项目的均值（x_）以及标准差（s），并根据x_和s计算各项目结果的变异系数（coefficient of variation，CV；CV＝s/x_），根据厂家试剂说明书要求，各项目批内精密度CV≤8%。② 批间精密度：选择两个不同浓度水平的原厂血栓四项质控品，并依据检测需要量分成5 等份，储存于-20 ℃冷冻冰箱，随后于连续5 d 内测定TM、TAT、PIC、tPAIC 结果，并根据上文公式计算CV。根据试剂说明书要求，各项目批间精密度CV≤10%。

1.3.2线性验证 参照CLSI 标准中定量测定方法的线性评价（Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures，EP6-A）文件［3］，选择原厂高浓度和低浓度质控品，分别使用原厂样本稀释液对每个浓度质控品稀释8 个阶段，不同浓度标本的稀释关系已知，使稀释后的样本浓度能覆盖整个线性范围，上述稀释操作完成后，每个标本测定检测项目3 次，随后，将所得项目结果的均值作为其中一点，将所得的实测值与理论值共8 组数据进行直线回归计算，并根据回归方程Y＝aX+B 及其对应的相关系数r2，验证检测试剂的线性范围，落在1±0.05范围内的回归方程斜率可判定为合格。

根据厂家试剂说明书要求，各指标正常参考值范围：TM 为1.0～200 TU/mL，TAT 为0.4～120 μg/L，tPAIC 为1～100 μg/L，PIC 为0.05～40 mg/L。各项目线性验证相关系数r2≥0.990 0，判定为合格。

1.3.3携带污染率 参照CLSI H57-A 文件［4］要求，进行携带污染率验证，具体方法如下：准备三个连续的检测位置，将低值标本置于第一和第三个位置，高值标本则置于二者之间，并将每个样本均检测3 次，最终结果需按照Low1、Low2、Low3、High1、High2、High 3、Low4、Low5、Low6 记录。则高值对低值样本的携带污染率＝［Low4 -（Low1、Low2、Low3 均值）］/（Low1、Low2、Low3 均值），低值对高值样本的携带污染率＝［High1 -（High1、High2、High3 均值）］/（High1、High2、High3 均值），因血栓四项的相关指南性文件中对于其检测项目的携带污染率规定尚不明确，故而本次实验可依据凝血相关性验证要求，CV＜10%为合格［5-7］。

1.3.4空白检出限验证 综合参照EP17-A 文件［8］及厂家空白检出限验证要求进行验证，采用零浓度（即无分析物）样本进行检测，本实验采用原厂样本稀释液，每个样本重复检测20 次，记录测量结果的相对发光值（relative light unit，RLU 值），并根据检测记录计算平均值（Z）和标准差（SD）并最终得出Z±2SD对应的RLU 值。因本仪器血栓四项试剂均采用夹心法原理检测，接下来依据夹心法试剂计算方法，即依据主校准曲线空白浓度校准品，与相邻浓度校准品之间的浓度与RLU 结果，进行两点回归，并拟合得出一次方程，随后将Z+2SD的RLU 值带入上文方程中，求出的对应浓度值即为空白限［9］。接受标准为不低于厂家试剂说明书所要求的空白限要求标准。

1.3.5正常参考值验证 本实验依据CLSI C28-A2文件［10］要求，随机抽取本院体检部20 名健康体检者的新鲜血浆标本，纳入标准如下：① 无重大肝病史；② 半年内无输血或大手术史；③ 身体各项发育指标及精神状态正常；④ 未服用过抗凝药物或避孕药等干扰凝血功能指标检测的药物。测定所收集标本并计算r值，r＝检测落在正常人参考值内的样本数/总样本数，r≥0.95 即认为验证通过。

1.4统计学处理 应用Excel 2010 软件对检测数据进行统计分析。

2 结果

2.1精密度验证结果 按照厂家试剂说明书要求，TM、TAT、PIC、tPAIC 项目的批内精密度要求CV≤8%，批间精密度要求CV≤10%，本研究验证结果均符合要求。见表1。

表1 国产免疫分析仪检测血栓四项的精密度验证结果

2.2线性验证 线性验证结果可见，TM理论值与实测值回归方程为Y＝0.988 6X-0.698 8，r2＝0.999 4；TAT 理论值与实测值的回归方程为Y＝0.987 3X-0.480 5，r2＝0.999 5；tPAIC 理论值与实测值回归方程为Y＝0.991 4X+8.479 1，r2＝0.994 4；PIC 理论值与实测值回归方程为Y＝0.992 9X-0.840 4，r2＝0.990 6；验证结果均为合格。

2.3携带污染率 TM 高值对低值携带污染率为-1.22%，低值对高值携带污染率为-2.63%，均符合要求。TAT 高值对低值携带污染率为3.04%，低值对高值携带污染率为0.31%，均符合要求。tPAIC 高值对低值携带污染率为-7.11%，低值对高值携带污染率为5.82%，均符合要求。PIC 高值对低值携带污染率为-6.04%，低值对高值携带污染率为0.21%，均符合要求。见表2。

表2 国产免疫分析仪检测新血栓四项的携带污染率验证结果

2.4空白检出限结果 TM 的空白检出限结果为0.017 08 TU/mL，试剂说明书要求为≤1.0 TU/mL；TAT的空白检出限结果为0.019 88 μg/L，说明书要求≤0.4 μg/L；tPAIC 空白检出限结果为0.001 34 μg/L，试剂说明书要求≤1.0 μg/L；PIC 空白检出限结果为0.000 65 mg/L，要求为≤0.05 mg/L；均验证通过。

2.5参考值范围验证结果 参考值范围验证结果可见，20 名健康体检者中，TM 最低值为7.05 TU/mL，最高值为13.28 TU/mL，均在厂家说明书参考值范围之内，符合要求。TAT 最低值为0.91 μg/L，最高值为3.76 μg/L，符合要求。tPAIC 最低值为男性2.862 μg/L，女性1.485 μg/L，最高值为男性16.782 μg/L，女性10.374 μg/L，符合要求。PIC 最低值为0.20 mg/L，最高值为0.57 mg/L，符合要求。见表3。

表3 国产免疫分析仪检测血栓四项参考范围验证结果

3 讨论

血栓性疾病发病隐匿、突然，病死率高，目前临床常用的凝血基础筛查项目属于血栓形成后的被动检测和晚期筛查项目［11］，对血栓前状态、弥漫性血管内凝血前期（pre diffuse intravascular coagulation，Pre-DIC）等疾病不敏感，血栓四项（TM、TAT、PIC、tPAIC）检测则能将血栓检测风险的关口前移。

TM 主要分布于毛细血管内皮细胞，在凝血酶激活启动蛋白C 的过程中起辅助作用。蛋白C 能灭活凝血途径的两个辅因子FⅤa、FⅧa，因此TM的水平高低调控着血管内皮细胞抗凝活性的强弱。TAT 不仅可以将血栓形成的预测关口前移，更有实验发现对于血栓再栓的复发也有预测意义；PIC 能够及时指导并提醒纤溶系统中纤溶酶分子的活跃程度，在溶栓治疗过程中对于再栓风险的指导意义重大；tPAIC 升高不止意味着此时人体血管内皮细胞可能受到损伤，同时也可认为人体内纤溶系统分子正处于活跃状态。有临床研究证明，血栓四项可能与肺癌疾病进展有关［12］。其中TAT、TM、PIC 水平在急性早幼粒细胞白血病患者的临床诊断及预后评估中也有较高价值［13］。联合检测血栓四项对早期诊断弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）具有临床指导意义［14-16，17-18］。PIC与tPAIC 与与多种心血管疾病的进展密切相关［19］。可见血栓四项检测的开展对临床患者的诊断及治疗具有积极的辅助意义。

日本希森美康株式会社是国际首发检测血栓四项的厂家，但因进口设备和试剂成本较昂贵，在很多中小型医院难以上线使用。广州万孚目前是国内较早主导并推动血栓四项检验试剂国产化的品牌，检测成本及经济负担相对会轻许多。

综上所述，本研究证实，广州万孚生物技术公司FC-302 全自动化学发光免疫分析仪符合检测血栓四项的性能验证要求。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突