皮质发育不良相关药物难治性癫痫患者的血浆微小RNA 表达谱

孙宇强 李庆伟 张远洋 闫晓枫 荣维娜 宋新宇 程化坤

作者单位：150036 黑龙江哈尔滨，黑龙江省医院神经外科（孙宇强、李庆伟、张远洋、荣维娜、宋新宇、程化坤），检验科（闫晓枫）

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，严重危害患者的健康，对社会和患者家庭都造成极大的经济负担。我国有近千万的癫痫患者，很多患者由于家庭经济条件较差，无法进行正规的治疗，最终发展为药物难治性癫痫［1］。难治性癫痫的危害很大，反复抽搐发作造成的神经系统损伤不断累积，不但加重了患者病情，更极大地延误了后续治疗（尤其是外科治疗）的时机［2］。尽管目前脑皮层电图已广泛应用于临床，但对癫痫的诊断仍然依赖于患者的病史询问。目前认为皮质发育不良（focal cortical dysplasia，FCD）可能是难治性癫痫的重要病因，关于难治性癫痫的诊断，目前尚没有明确统一的标准［3-4］。因此急待寻找能对难治性癫痫进行早期、准确、有效、安全、快速诊断的评估手段，从而在整体上改善难治性癫痫的预后，具有临床意义。

微小RNA（micro RNA，miRNA）是一类自然生成的核苷酸小RNA 分子，具有较高的组织特异性。miRNA 在人类疾病的分子诊断中拥有巨大的潜能，尤其是一些缺乏客观监测指标的疾病，通过对简单易得的体液（如血浆、脑脊液等）进行检测，如果能够发现某个或者某类miRNA 在难治性癫痫患者中表达明显改变，且对疾病诊断具有明确的指导意义，就能建立一种客观、准确的标准来对癫痫患者进行诊断与治疗［5-6］。有研究表明，临床上难治性癫痫最主要的病理改变是局灶性FCD［7］。有研究证实，miR-129-2-3p 在FCD 相关难治性癫痫动物模型中的表达水平明显升高［8］。目前多数研究均采用动物模型来探讨miRNA 与癫痫的关系，而采用基因芯片方法探讨癫痫患者中药物难治性癫痫与miRNA关系的研究较少。本研究通过分析FCD 相关药物难治性癫痫患者的血浆miRNA 表达谱，旨在为临床诊断靶点的探索提供数据支持，现报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象及临床资料 采用随机对照研究方法，从辽宁省癫痫疾病诊疗中心术后切除的大脑致痫灶皮质标本中挑选出9 份经病理检查证实符合FCD 的样本，同时选取8 份正常脑组织样本作为对照皮质。另选同期在黑龙江省医院手术治疗的60 例FCD 相关药物难治性癫痫患者作为研究对象，分别采集手术切除的致痫灶脑皮质组织及患者血浆作为检测标本。其中男性32 例，女性28 例；年龄21～48 岁，平均（35.64±1.29）岁；病程3～12 年，平均（7.24±1.23）年；病程≥5 年41 例，＜5 年19 例；发作频率1～12 次/月，平均（6.24±0.32）次/月，发作频率≥4 次/月36 例，＜4 次/月24 例；预后良好43 例，预后不良17 例。

1.1.1纳入标准 ① 均符合FCD 相关药物难治性癫痫的诊断标准；② 年龄≥20 岁；③ 患者及家属对本研究已知情同意，并已签署同意书。

1.1.2排除标准 ① 合并其他神经系统性疾病者；② 合并恶性肿瘤患者；③ 合并血液系统疾病患者；④ 病历资料数据缺失者。

1.1.3伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理委员会审批（审批号：SYYLLBA202132）。

1.2研究方法 采用Affymetrix 4.0 miRNA 基因芯片（北京博奥晶典生物技术有限公司）对两组脑组织标本筛选出差异miRNA 表达谱。通过实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR），采用7500 实时荧光定量PCR 仪（美国赛默飞公司）考察miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在FCD 相关致痫灶脑皮质组织及患者血浆中的表达量，qRT-PCR 试剂盒购自北京天根公司。检测时先采集致痫灶脑皮质组织标本2 g 及患者血浆标本4 mL，分别提取总RNA，采用反转录试剂盒（购自北京天根公司）先将待测标本反转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），而后实施qRT-PCR 检测。反应体系为20 μL，其中即用型预混液8.0 μL，cDNA 4.0 μL，上/下游引物分别为0.8 μL，添加无RNA酶水6.4 μL。相关反应条件为：95 ℃ 5 min，相同温度下30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38 个循环。miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 引物序列均由北京博奥晶典生物技术有限公司设计制作。测定结果通过2-△△Ct法计算各指标的相对表达量。

1.3观察指标 ① 比较两组脑组织中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 的相对表达量；② 比较FCD 相关难治性癫痫患者脑组织和血浆中的miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p及miRNA-485-3p 的相对表达量；③ 比较不同病程、发作频率、预后患者血浆中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表达量；④ 分析血浆中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 对FCD 相关药物难治性癫痫的诊断价值。

1.4统计学方法 采用SPSS 24.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）并计算ROC 曲线下面积（area under ROC curve，AUC）分析血浆中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p对FCD相关药物难治性癫痫的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1FCD 脑组织和正常脑组织样本中的miRNA 相对表达量比较 FCD 脑组织中的miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的相对表达量均明显高于对照皮质（均P＜0.05）。见表1。

2.2FCD 相关难治性癫痫患者脑组织和血浆中的miRNA 相对表达量比较 FCD 相关难治性癫痫患者血浆中的miRNA-129-2-3p 相对表达量较脑组织中均明显更高（均P＜0.05）。miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p、miRNA-485-3p 在FCD 相关难治性癫痫患者血浆及脑组织中的表达量比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

2.3不同病程、发作频率以及预后FCD 相关难治性癫痫患者血浆中miRNA 的表达量比较 病程≥5 年、发作频率≥4 次以及预后不良患者血浆中的miRNA-129-2-3p 表达水平均明显高于病程＜5 年、发作频率＜4 次以及预后良好患者（均P＜0.05）。不同病程、发作频率以及预后患者血浆中miRNA-935、miRNA-4521、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表达量比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见图1～3。

图1 不同病程患者血浆中miRNA 的表达量比较

图2 不同发作频率患者血浆中miRNA 的表达量比较

图3 不同预后患者血浆中miRNA 的表达量比较

2.4FCD 相关药物难治性癫痫患者血浆中miRNA表达量对疾病的诊断价值 ROC 曲线分析结果显示，血浆中miRNA-129-2-3p 对FCD 相关药物难治性癫痫的诊断价值最高，AUC 为0.894，95%可信区间（95% confidence interval，95%CI）为0379～0.974，敏感度为93.66%。见表3。

表3 血浆中miRNA 表达量对FCD 相关药物难治性癫痫的诊断价值

3 讨论

癫痫作为一种临床十分常见的神经系统疾病，通常是由于患者的脑神经发生异常性过度放电或同步化活动而引起的相关病症。临床有研究显示，癫痫患者在初始发病时的年龄往往较小，且可能会长期反复发作，从而严重危害患者的身心健康［9-11］。一般认为，癫痫的发病时长大于20 min 则可能会导致大脑皮层处于缺血缺氧状态，而若时长大于1 h，则可能导致患者的脑组织发生不可逆的损伤，严重者甚至会直接导致全身性的器官功能衰竭或脑死亡等，危害较大［12-13］。

FCD 属于一类脑皮质发育畸形状态，在整体癫痫患者群体中占比为40%～50%［14-15］。既往临床通常首选药物治疗癫痫，但部分患者易出现耐药性，导致治疗效果欠佳，手术疗法对药物难治性癫痫虽然具有一定疗效，但依然存在少数患者的预后不佳，且术后仍会存在癫痫发作症状，较大地影响了患者的生存状态［16-17］。因此，寻找一种科学、精准的生物标志物对FCD 相关药物难治性癫痫患者的临床诊断具有重要的应用价值。

本研究表明，FCD 脑组织中miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 以及miRNA-485-3p 的相对表达量较对照组明显更高，提示miRNA-129-2-3p、miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在FCD 脑组织中均呈现出高表达状态。究其原因主要是由于上述检测指标均为miRNA 的家族成员，且在癫痫发病进程中不同程度地参与了神经系统的炎症应激反应和神经元坏死、神经细胞的凋亡和树突生长以及突触重塑和胶质细胞的增生等过程中，同时与癫痫网络的产生和神经递质及受体功能的损伤存在紧密关联［18-19］。同时，本研究结果显示，FCD 相关难治性癫痫患者血浆中miRNA-129-2-3p 的相对表达量较脑组织中明显更高。miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 在患者血浆及脑组织中的表达差异无统计学意义。这提示了血浆中miRNA-129-2-3p 的高表达可能对FCD 相关难治性癫痫患者具有较好的诊断效果，且诊断价值较脑组织更高。miRNA-129 主要是通过miR-129-1 及miRNA-129-2 这两个基因转录而形成，其中前者主要位于人体的7 号染色体，而后者主要位于11 号染色体的双核苷酸CpG 岛上［20］。miRNA-129-3p 是经前体3'端处理后产生的成熟型miRNA，而miRNA-129-2前体经过剪切加工后最终形成成熟的miRNA-129-2-3p。miRNA-129-1 前体则可加工产生成熟型miR-129-5p。马雪莲等［21］研究指出，miRNA-129-5p 的高表达能够有效缓解阿尔兹海默症模型大鼠的神经损伤以及炎症反应，且miRNA-129-5p/SOX6信号通路可能有助于临床治疗。因此，miRNA-129-2-3p 可能亦是通过某种信号通路而影响FCD 相关难治性癫痫的发病进程，这也值得后续深入探索。事实上，由于脑组织标本的提取过程比较困难，血浆miRNA-129-2-3p 若能实现更佳的诊断价值，则有可能更有助于在临床诊治过程中的应用和推广。

本研究结果显示，病程≥5 年、发作频率≥4 次以及预后不良患者血浆中miRNA-129-2-3p 的表达水平分别较病程＜5 年、发作频率＜4 次以及预后良好患者明显升高。不同病程、发作频率以及预后患者血浆中miRNA-4521、miRNA-935、miRNA-323a-5p 及miRNA-485-3p 的表达比较差异均无统计学意义。进一步根据ROC 曲线分析表明，血浆中miRNA-129-2-3p 对FCD 相关药物难治性癫痫的诊断价值最高，其中AUC 为0.894，敏感度为93.66%。上述结果再次表明了血浆中miRNA-129-2-3p 对FCD 相关药物难治性癫痫的病情及预后均具有较高的诊断价值，可以用于临床对该疾病的有效监测［22-23］。

综上所述，FCD脑组织中miRNA 呈高表达，血浆中的miRNA-129-2-3p 高表达可能对FCD 相关难治性癫痫患者具有较高的诊断价值，值得关注。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突