AOPPs靶向调控ROS/Wnt/β-catenin/Snail1通路对局灶节段性肾小球硬化大鼠的影响及右归丸干预研究*

王新斌,李 赟,马睿玲,张 怡,王 蓉,李新梅,水蓉枝

(甘肃中医药大学中西医结合学院,甘肃 兰州 730000)

局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是一种肾小球损伤的组织形态学模式,涉及几种完全不同的临床疾病,以足细胞损伤作为主要病理特征[1]。其发病机制包括遗传因素、足细胞损伤、循环因子等,其中足细胞损伤是引起FSGS事件的核心环节[2]。足细胞容易受到氧化应激失衡的影响,从而发生功能障碍而引发蛋白尿[3]。最新的研究表明,Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)/Snail1信号通路在晚期氧化蛋白产物(AOPPs)/活性氧(ROS)介导的足细胞损伤中发挥着重要作用[4-9]。根据KDIGO指南[10],治疗FSGS一线药物常以激素和免疫抑制剂为主,但有大量患者的治疗效果不佳,疾病最终发展为终末期肾衰竭,因此,迫切需要探索有效治疗方案,寻找新的治疗靶点。右归丸源于六味地黄丸,化裁于金匮肾气丸,以“益火之源,培补肾之元阳”[11]而名贯千古。近年来,有关右归丸的现代药理学研究证明,右归丸具有调节中枢神经系统及下丘脑-垂体-靶腺轴、抗炎、抗氧化、保护肝肾功能等多种药理活性[12]。本课题组前期的临床研究[13]已证实,在激素治疗FSGS时,辅以右归丸治疗,蛋白尿明显下降,肾脏功能预后得到改善,但其对FSGS的影响及机制尚不明确。因此,本实验通过尾静脉注射阿霉素复制FSGS模型大鼠,探究右归丸对FSGS大鼠足细胞损伤的保护作用,探讨其对AOPPs介导ROS/Wnt/β-catenin/Snail1信号通路的影响,以期揭示右归丸的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD大鼠60只,雄性,8周龄,体质量(220±10)g,购自甘肃中医药大学动物中心,动物生产许可证号和动物使用许可证号分别为SCXK(甘)2015-0002、SYXK(甘)2015-005。本实验研究经甘肃中医药大学动物伦理委员会批准(批号L20150124)。大鼠饲养于甘肃中医药大学SPF实验中心,温度(22±4)℃,湿度(42±4)%。所投放的SPF级大鼠饲料均经过辐照灭菌以保证无污染,自由饮水。

1.2 药物、试剂与仪器

右归丸,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂产品,批号11030027;阿霉素,湖北鑫红利化工有限公司产品,批号L12174。白蛋白(Alb)、尿肌酐(UCr)试剂盒,南京建成生物工程研究所产品,批号依次为A028-2-1、C011-2-1;ROS、AOPPs检测试剂盒,美国西格玛公司产品,批号依次为RAB0311、RAB0277;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体、羊抗鼠IgG、β-actin抗体,上海碧云天生物技术有限公司产品,批号依次为C0105S、A0239、A0192、AF5001;Snail1抗体、Wnt1抗体、β-catenin抗体,英国艾博抗公司产品,批号依次为ab31787、ab38449、ab32536。JEM-1400 Flash型透射电子显微镜,日本电子株式会社产品;EMUC7型超薄切片机,德国徕卡公司产品;GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜,日本尼康公司产品;TWK-FST32型组织匀浆仪,武汉泰普拓公司产品;FC型全自动多功能酶标检测仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;1658033型电泳仪,美国伯乐公司产品;Light Cycler 480型实时聚合酶链反应(real-time PCR)仪,瑞士罗氏公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

大鼠适应性饲养7 d,按体质量随机分为空白组、模型组、醋酸泼尼松组和右归丸高、中、低剂量组,每组10只。模型组和各药物组均采用尾静脉一次性注射阿霉素6.5 μg/g体质量诱导法制备FSGS模型[14],空白组尾静脉注射质量分数9 g/L生理盐水1 μL/g体质量。以24 h尿蛋白>100 μg/g为FSGS造模成功标准。50只动物均造模成功。模型复制成功后,右归丸低、中、高剂量组依次给予右归丸混悬液2.8、5.6、11.2 g/(kg·d)灌胃,醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松混悬液6.3 μg/(g·d) 灌胃,空白组、模型组给予9 g/L生理盐水10 μL/(g·d)灌胃,连续6周。

1.4 检测指标与方法

末次给药后禁食不禁水,用粪尿分离式代谢笼收集24 h尿液,收集的尿液分装到加有0.1 g/L叠氮化钠的EP管中,4 ℃保存,用于尿常规检查;腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠,将大鼠仰置在操作台上,在大鼠左侧心尖搏动处垂直刺入采血针,用生化管收集血液6～8 mL,待检;断椎处死大鼠,摘除双肾,一侧肾脏用于HE染色和肾脏组织超微病理观察;另一侧肾脏进行低温匀浆, -80 ℃保存,用于免疫印迹法(Western blot)和real-time PCR检测。

1.4.1 尿Alb、UCr与Alb/UCr比值

检测时,尿液的样本和试剂盒室温放置20 min,按照试剂盒说明书检测Alb、UCr,计算Alb/UCr(A/U)比值。

1.4.2 肾组织病理学形态

将肾组织固定于40 g/L多聚甲醛溶液中,经0.1 mol/L PBS缓冲液洗涤,梯度乙醇、二甲苯脱水,石蜡包埋,纵向切片(厚4 μm),石蜡片经二甲苯、梯度无水乙醇水化后用苏木精-伊红(HE)染色,在200倍倒置显微镜下观察。

将肾组织放入10 mL/L 锇酸中,4 ℃下固定3 h,用不同体积分数的乙醇脱水15 min,室温下将脱水组织块分别于纯丙酮、丙酮-包埋树脂(1∶1)和包埋树脂中浸透3 h,转移至装满包埋树脂的硅胶胶囊模具中,60 ℃下固化约48 h,切割成70 nm厚度切片,铀、铅双染色各5 min,室温下干燥过夜,于透射电子显微镜下观察肾组织超微结构。

1.4.3 血清AOPPs含量

4 ℃下,以离心半径6 cm、转速3 000 r/min离心,取血清,按照试剂盒说明书检测血清AOPPs含量。

1.4.4 肾组织ROS含量

于-80 ℃冰箱中取出肾组织,充分研磨,按照试剂盒说明书检测肾组织ROS含量。

1.4.5 肾组织Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白水平

采用Western blot法检测。将肾组织研磨,裂解后进行蛋白质提取,蛋白浓度检测采用BCA法试剂盒。随后取变性后蛋白进行上样,10% SDS-PAGE凝胶电泳,后湿法转膜;将膜暴露于封闭缓冲液中2 h,在4 ℃下与一级抗体Snail1( 1∶1 000)、Wnt1(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000) 孵育过夜;在室温下加入对应的羊抗兔 IgG(1∶2 000) 或羊抗鼠IgG(1∶5 000)孵育1 h,摇床摇晃上加TPBS洗涤3次,ECL显色,显影并拍照,选用ImageJ图像处理软件分别测得目的蛋白与内参蛋白条带灰度值,以两者的比值反映各蛋白表达水平。

1.4.6 肾组织Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA水平

采用real-time PCR法检测。取各组肾组织0.5 g,均加入Trizol 1 mL,置于冰上,研磨匀浆,振荡后4 ℃下以离心半径10 cm、转速15 000 r/min离心,取上清液,加入氯仿离心,水相和有机相两相分离,异丙醇、乙醇提纯,分光光度计260 nm/280 nm检测总RNA纯度,互补核糖核酸(cRNA)反转录互补脱氧核糖核酸(cDNA)操作过程严格按照逆转录试剂盒说明书进行。real-time PCR反应体系2×SYBR®PremixExTaqTM10 μL,引物F、R各1 μL,无核酸无酶水2 μL,Cdna 2 μL。循环过程95 ℃10 min,第1次循环95 ℃ 2 min,后40次循环95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s。溶解曲线制备65 ℃升至95 ℃,0.5 ℃/s。以β-actin为参比基因,引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

空白组大鼠精神、活动、饮水、饮食未见异常。模型组大鼠精神萎靡,活动减少,毛色枯槁,弓背耸肩,常蜷卧饲养笼一角,饮食、体质量减少。右归丸低、中、高剂量组和醋酸泼尼松组大鼠较模型组大鼠活动逐渐增加,皮毛光泽渐显,饮食量略有增加,体质量与24 h尿蛋白呈正相关性。

2.2 各组大鼠尿Alb、UCr和A/U对比

与空白组对比,模型组尿Alb、UCr水平及A/U升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,右归丸组尿Alb、UCr、A/U下降(P<0.05),且呈量效相关性。与醋酸泼尼松对比,右归丸高剂量组尿Alb、UCr水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠Alb、UCr和A/U对比

2.3 各组大鼠肾组织病理学形态对比

光镜下:与空白组对比,模型组可见肾小球体积变大且有水肿显现,肾小球囊粘连,系膜增生,毛细血管腔狭窄,肾小管上皮细胞呈空泡性。醋酸泼尼松组肾小球、肾小管损伤得到一定改善,病理损伤程度减轻。右归丸3个剂量组肾组织病理损伤改善,毛细血管袢开放良好,毛细血管腔略显狭窄,基底膜增生、囊壁粘连及小管上皮细胞病变显著减缓,改变呈量效相关性。见图1。

注:A.空白组;B.模型组;C至E依次为右归丸低、中、高剂量组;F.醋酸泼尼松组

透视电镜下:空白组大鼠足突呈线性分布且排列整齐,肾小球基底膜无异常变化。模型组肾小球基底膜薄厚不均,基底膜侧有钉突,足突短粗且出现严重融合。醋酸泼尼松组基底膜的损伤明显改善,足突轻度融合。右归丸3个剂量组肾小球基底膜损伤明显好转,足突的数量和密度恢复趋好,虽融合现象较明显但可见较多较长足细胞且排列较紧密,且呈剂量相关性。见图2。

注:A.空白组;B.模型组;C至E依次为右归丸低、中、高剂量组;F.醋酸泼尼松组

2.4 各组大鼠血清AOPPs、肾组织ROS含量对比

与空白组对比,模型组大鼠血清AOPPs、肾组织中ROS含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,醋酸泼尼松组、右归丸组大鼠的AOPPs、ROS含量减少(P<0.05)。醋酸泼尼松组与右归丸高剂量组对大鼠AOPPs、ROS含量对比,差异无统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠血清AOPPs、肾组织ROS含量对比

2.5 各组大鼠肾组织中Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表达量对比

与空白组对比,模型组肾组织中Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,各药物组肾组织Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表达量均增加(P<0.05)。醋酸泼尼松组与右归丸高剂量组Wnt1、β-catenin及Snail1蛋白表达量对比,差异无统计学意义。见图3和表4。

注:A.空白组;B.模型组;C至E依次为右归丸低、中、高剂量组;F.醋酸泼尼松组

表4 各组大鼠肾组织Wnt1、β-catenin、Snail1蛋白表达量对比

2.6 各组大鼠Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表达量对比

与空白组对比,模型组Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,醋酸泼尼松组和右归丸各组Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表达量下调(P<0.05)。与醋酸泼尼松组对比,右归丸组在下调Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA的作用弱于醋酸泼尼松组见表5。

表5 各组大鼠Wnt1、β-catenin、Snail1 mRNA表达量对比

3 讨 论

FSGS是肾病综合征常见的病理类型之一,临床治疗中常存在激素抵抗或类固醇耐药的现象。据报道,给予大剂量激素治疗后仍有50%疗效欠佳,且5～10年迅速发展为终末期肾病[15]。因此积极探索一种作用确切、安全有效治疗方案来延缓或抑制FSGS病程进展已成为目前国内外肾病研究者关注的热点。右归丸是医家治疗肾性疾病常用的古方之一。本课题组前期临床研究证实,右归丸可改善患者24 h尿蛋白含量,保护肾功能,同时能下调多耐药基因1、P-糖蛋白170的表达,上调糖皮质激素受体-α(GRα)低表达量,从而增加难治性肾病综合征患者对类固醇激素的敏感性[16]。蛋白尿是FSGS肾病主要的临床症状,是由足细胞的损伤使致肾小球过滤屏障缺陷而致。现在越来越多的研究者把治疗FSGS的靶点聚焦于足细胞,并认为FSGS肇始于足细胞的损伤。研究[17]指出,AOPPs的积累通过激活 ROS 依赖的Wnt/β-catenin信号通路促进靶基因Snail的转录,引起nephrin和podocin的表达异常,从而导致蛋白尿发生。

蛋白尿是导致FSGS发生的关键因素,同时也是该病病程进展的加重因素,因此,尿蛋白量是防治FSGS的关键性指标之一。尿蛋白/肌酐(ACR)是能准确反映尿微量白蛋白排泄的指标[18]。本研究结果显示,模型组大鼠肾脏病理损伤明显,尿Alb、UCr及A/U值升高,右归丸干预后ACR水平明显下降,肾脏的病理损伤程度及足细胞融合度明显降低。结果提示,右归丸可降低FSGS大鼠尿蛋白含量,缓减肾脏病理损害,对肾脏具有保护作用。此与于晓霞等[19]的研究结果一致。

氧化应激既是造成足细胞损伤的原因之一,又是FSGS发生发展的主要机制。ROS是生物系统中重要的氧化应激因子,过量的ROS引发应激反应导致血中的白蛋白被氧化为AOPPs;而AOPPs是一类促炎症、促氧化的大分子生物毒素,随血液循环沉积在肾脏中而诱导足细胞发生上皮细胞-间充质转化(EMT)。目前有研究[20]表明,EMT事件是AOPPs诱导足细胞损伤的结果,也可能是FSGS早期发病的关键因素。本研究结果显示,模型组大鼠血清AOPPs、肾组织中ROS水平均显著升高,右归丸治疗后大鼠AOPPs、ROS含量明显减少。由此笔者推测,ROS介导AOPPs是足细胞形成EMT的主要因素,且右归丸可能通过抑制AOPPs、ROS减轻足细胞发生EMT从而保护肾脏。

随着沉积在肾脏中AOPPs量逐渐升高,刺激足细胞糖基化终产物受体并激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化酶,激活后上调的NADP氧化酶诱导细胞(足细胞、内皮细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞)产生ROS,进而激活Wnt/β-catenin信号通路。被激活的 Wnt/β-catenin信号又反过来能激活 ROS介导的氧化应激性反应,造成肾组织纤维化恶性循环。有研究[21-22]发现,在阿霉素诱导的肾病小鼠模型中Wnt/β-catenin信号激活优先于蛋白尿的发生,而特异性去除β-catenin的小鼠可以免受阿霉素诱导的足细胞损伤。前期研究[13]表明,足细胞是右归丸作用的主要靶点。本研究结果显示右归丸可减少FSGS大鼠肾小球 Wnt1、β-catenin mRNA和蛋白质表达,此为右归丸治疗足细胞疾病提供了一定的理论依据。

研究[23]表明,当Wnt受到外界刺激时,其蛋白的表达量随之增加,使β-catenin逃逸泛素水解系统降解而在细胞内积聚,游离状态的β-catenin进入细胞核与TCF/LEF结合,募集蛋白P300在内的共激活因子,促进靶基因Snail1转录。Snail1是一种锌指转录抑制因子,在诱导肾小管上皮细胞发生EMT、促进肾脏纤维化起关键作用。Boutet 等[24]研究发现,成年转基因小鼠Snail1活化后可诱导肾纤维化和EMT。王晓彤等[25]发现:高糖刺激48 h后,足细胞Snail1 mRNA和蛋白显著表达,而nephrin 表达则明显下调;雷公藤甲素干预后,Snail1 mRNA和蛋白表达量明显减少,而 nephrin mRNA及蛋白表达量较高糖组增加;足细胞中高的Snail1可抑制足细胞裂孔隔膜分子nephrin表达,诱发蛋白尿的发生和肾纤维化。本研究结果显示,FSGS大鼠组织中Snail1 mRNA和蛋白表达量明显上调,通过右归丸干预,各剂量组大鼠肾组织中Snail1 mRNA和蛋白表达量显著下调,提示右归丸通过抑制Snail 1高表达而发挥治疗FSGS的作用。此与国内研究结果相一致。

综上所述,右归丸通过下调氧化应激因子AOPPs、ROS进而抑制FSGS大鼠ROS/Wnt/β-catenin/Snail1信号通路传导,实现对足细胞功能的保护,延缓FSGS病程的进展。本研究为阐明FSGS产生的分子机制提供了一定参考,同时也为中医药防治FSGS提供了新的治疗靶点。