基于乳酸相关基因肠癌预后模型的建立与分析

钟世顺 梁玮 许炎钦 刘进生

肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率在男性和女性中均居前五位[1]。随着治疗技术的发展，肠癌患者5 年生存率在过去20 年中逐渐提高[2]，但死亡率仍然较高。因此，挖掘肠癌发生发展过程中的生物标志物具有重要意义。

乳酸是糖无氧酵解代谢的终产物，以前被认为是癌症进展中的无用代谢物。最近的研究表明，乳酸是癌症发展、维持肿瘤微环境和转移的重要调节剂[3]。在乳腺癌中，乳酸相关基因GPR81 表达上调并通过从肿瘤细胞中释放乳酸来促进肿瘤生长[4]；有研究表明，乳酸脱氢酶A 是肾透明细胞癌的预后标志物[5]。乳酸/BDNF/TrkB 信号可介导上皮-间质相互作用并导致胃癌细胞对安罗替尼产生耐药性[6]。有研究表明，乳酸与肿瘤免疫微环境相关，乳酸水平升高是肿瘤微环境酸中毒的主要原因，其抑制CD8+和CD4+效应T 细胞功能，并有利于免疫抑制性Treg 细胞的发育[7]。

乳酸在癌症进展、预后和免疫微环境中具有重要价值。然而，乳酸相关基因在肠癌中尚未得到很好的研究。本研究开发并验证了一种乳酸相关基因预后模型来预测肠癌患者的预后及免疫浸润，可能为肠癌患者预后评估提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 数据采集本研究利用TCGA 及GEO 数据库获得肠癌患者癌组织及癌旁组织的基因表达数据，TCGA 肠癌数据集包含456 例肠癌患者癌组织及41 例癌旁组织，GSE39582 数据集包含585 例肠癌患者组织及临床数据。通过“乳酸”作为搜索关键词查询Molecular Signatures Database（MSigDB）数据库，获得了284 个乳酸相关基因。

1.2 鉴定肠癌中差异表达的乳酸相关基因利用“ limma”R 包分析TCGA 数据集中肠癌组织和癌旁组织的差异表达中乳酸相关基因。将|log2FC|≥0.585 且FDR<0.05 的基因定义为差异表达基因。

1.3 肠癌乳酸相关基因预后模型的构建和验证利用单变量Cox 回归分析确定了具有预后价值的乳酸相关基因，然后使用“glmnet”R 包对单变量Cox回归分析获得的具有预后价值的基因进行LASSO回归分析。在LASSO 分析中，先通过10 倍交叉验证检测获得最佳调谐参数lambda（λ），根据最佳λ 值获得具有系数的预后基因列表。乳酸相关基因预后模型Risk Score 的得分为每个基因的系数×相应基因的表达值的总和。Kaplan-Meier 生存分析对不同风险组进行预后评估。此外，按照年龄、性别及stage 对肠癌患者进行亚组分层，评估预后模型在不同亚组中的临床价值。

1.4 评估两个Risk score 组的免疫浸润基于TCGA 肠癌数据，并通过CIBERSORT 算法评估每个肠癌组织中肿瘤浸润免疫细胞的比例，分析不同风险组的免疫浸润差异。

1.5 统计学分析采用Student't检验计算差异性表达。通过Kaplan-Meier 方法计算总生存率，并通过log-rank test 检验分析各组之间的差异。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定肠癌患者组织中差异表达的乳酸相关基因基于TCGA 数据集，我们分析了284 个乳酸相关基因在肠癌患者组织及癌旁组织中的差异表达。结果显示与癌旁组织相比，肠癌组织中有36 个基因表达显著上调，42 个基因表达显著下调（见图1），其中表达上调倍数最高的前5 个基因分别是HS6ST2、CA5A、PUS1、TWNK 和PNPT1；下调倍数最高的前5 个基因分别是COX6A2、PCK1、LDHD、LDHAL6B 和SLC3A1。

图1 基于TCGA 数据分析肠癌患者组织中差异表达的乳酸相关基因

2.2 乳酸相关基因预后模型的开发与评估通过单变量Cox 回归分析78 个差异表达基因对肠癌患者预后的影响。结果显示TPK1 及MPC1 是肠癌患者的预后影响因素（见图2A）。利用LASSO 回归分析建立乳酸相关基因预后模型。结果显示当LASSO 模型中的调谐参数（λ）=0.0017 时，模型可以达到最佳拟合（见图2B）。此时，TPK1 和MPC1基因的LASSO 系数分别是-0.307 和-0.309（见图2C）。因此，乳酸相关基因预后模型Risk Score=（-0.307×TPK1 表达量）+（-0.309×MPC1 表达量）。随后，我们评估了乳酸相关基因预后评估模型在肠癌患者预后预测中的能力。Kaplan-Meier 生存分析结果表明Risk Score 高（高风险组）的患者生存期显著短于Risk Score 低（低风险组）的肠癌患者（见图2D）。图2E 展示了Risk Score 相关基因、Risk Score 及肠癌患者预后之间的相关性。从图中可看出TPK1 和MPC1 基因的表达越低，则Risk Score越高；Risk score 越高，则肠癌患者预后越差。

图2 乳酸相关基因预后模型的构建

为了评估乳酸相关基因预后模型的稳定性，我们将肠癌患者进行分层及Kaplan-Meier 生存分析，以进一步探讨该预后模型是否适用于不同的临床亚组。在女性肠癌患者（见图3A）及男性肠癌患者（见图3B）的亚组中，高风险组的患者整体生存显著差于低风险组。在患者年龄≤60 岁（见图3C）、患者年龄>60 岁（见图3D）、患者Stage=1&2（见图3E）及患者Stage=3&4（见图3F）的亚组中，高风险组肠癌患者整体生存也是显著低于低风险组。

图3 预后模型的不同临床亚组验证

2.3 乳酸相关基因预后模型的验证为了进一步评估该预后模型的有效性，我们使用了GSE39582肠癌数据集作为验证集。生存分析结果显示，在GSE39582 数据集中，高风险组的肠癌患者整体生存显著差于低风险组（见图4）。

图4 预后模型的验证

2.4 乳酸相关基因预后模型与免疫浸润为了进一步研究两个风险组间的免疫浸润差异，利用CIBERSORT 分析两组之间的免疫细胞浸润情况。结果表明在低风险组中，T cells CD4 memory resting免疫细胞的浸润情况显著低于高风险组（见图5）。

图5 高风险组及低风险组的免疫浸润分析

2.5 Nomogram 的构建和评估为了使我们的模型更好地辅助临床决策，我们构建了一个列线图来预测1 年、3 年和5 年的生存率（见图6A），校准曲线证明我们的预后列线图可以准确预测生存率（见图6B）。

图6 Nomogram 的构建与评估

3 讨论

肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其特征在于肿瘤细胞和肿瘤微环境的肿瘤异质性会使肠癌的治疗复杂化[8，9]。最近的研究揭示了乳酸在肿瘤免疫微环境中的不同作用。尽管癌细胞有足够的氧气供应，但仍然会消耗葡萄糖并过度产生乳酸，这可能会导致酸中毒、血管生成和免疫抑制[10]。在多种肿瘤中，乳酸对于预测预后和肿瘤微环境至关重要[11]。然而，乳酸在肠癌中的预后价值在很大程度上仍然未知。本研究分析了乳酸相关基因在肠癌的预后预测及免疫微环境中的作用。

本研究先确定了78 个差异表达的乳酸相关基因，接着利用Cox 回归分析、LASSO 分析构建肠癌乳酸相关基因预后模型，该模型包含TPK1 和MPC1 两个基因。研究表明，TPK1 可以促进肿瘤的进展[12]。TPK1 在肠癌中的作用还未得到充分研究，目前的研究主要集中在肝癌、胰腺癌和宫颈癌等其他类型的肿瘤上。研究显示，TPK1 可以促进肿瘤细胞的代谢和增殖，增强其对营养物质的利用，从而促进肿瘤生长和转移[13～15]。但是，TPK1 在肠癌发生、发展、治疗等方面的具体作用还需进一步研究。MPC1 是一种介导细胞质和线粒体内丙酮酸转运的蛋白质[16，17]。一些研究表明，MPC1 可以调节肠癌细胞的代谢和增殖，从而影响肠癌的发生和发展。具体来说，MPC1 在肠癌细胞中的表达水平通常会升高，高表达的MPC1 会增加肠癌细胞对外源性丙酮酸的摄取和利用，从而增加肠癌细胞的代谢和增殖能力[18]。此外，MPC1 在肠癌细胞的生存和细胞内ATP 生成中也发挥着重要作用。

进一步的生存分析验证了肠癌乳酸相关基因预后模型的可靠性。临床亚组分层分析结果表明，该预后模型适用于不同的肠癌临床亚组。考虑到免疫细胞在肿瘤免疫浸润中的重要性，我们进一步评估了每个结肠癌标本中免疫细胞的相对比例。有证据表明，肿瘤和微环境之间的相互作用在结肠癌的进展和对免疫疗法的反应率中起至关重要的作用[19，20]。本研究发现低风险组中，T cells CD4 memory resting 免疫细胞的浸润情况显著低于高风险组。有研究发现T cells CD4 memory resting 浸润程度高与肠癌预后较差相关[8]。因此，乳酸相关基因预后模型评估肠癌的预后价值可能与T cells CD4 memory resting 免疫细胞浸润程度相关。此外，Nomogram 的构建为临床医生做出决策提供参考。

本研究结果表明乳酸相关基因与肠癌患者预后密切相关，说明乳酸可能与肠癌具有一定的关联，但是同样值得注意的是，除了人体器官会产生乳酸，双歧杆菌等微生物也会产生乳酸。双歧杆菌可以发酵肠道中的不可消化的多糖等物质，产生乳酸和其他短链脂肪酸，为肠道细胞提供能量和营养物质，同时还可以降低肠道内的pH 值，影响病原微生物的生长[22]。相比于其他器官，肠道内乳酸的来源相对复杂，有待进一步深入挖掘乳酸在肠癌中的作用。

本研究存在一些局限性：首先，需要更多的临床样本来验证该预后模型；其次，需要进一步研究乳酸与肠癌免疫浸润的相关性。

综上，本研究探讨了乳酸相关基因与肠癌之间的关联，通过建立乳酸相关基因预后模型以预测肠癌患者的存活率，可能为肠癌临床诊治提供一定的帮助。