血清miR-143、miR-21 对乙型肝炎病毒相关性肝纤维化的早期诊断价值

张小博 赵华山 马鹏飞

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）造成的肝脏疾病，其主要病理基础是肝纤维化，随着病情的发展可进展为肝硬化甚至肝癌，具有较高的致死率，对家庭及医疗系统均造成了一定的负担[1]。在肝纤维化发生初期，及时采取有效的治疗措施能一定程度逆转肝纤维化，因此在乙型肝炎患者抗病毒治疗的过程中，明确早期肝纤维化的影响因素，并及早做出有效诊断以采取干预措施逆转肝纤维化的发展，对于改善预后有重要意义[2]。目前临床诊断肝纤维化的“金标准”是肝组织活检，该方式属于有创操作，难以广泛开展，而常用的透明质酸、四型胶原、Ⅲ型前胶原肽、层黏连蛋白等血液肝纤维化指标对早期肝纤维化诊断的特异性较差[3，4]。故寻求更为有效地反映肝纤维化早期的无创指标具有重要意义。miRNAs 作为广泛存在于动植物体内的非编码单链RNA 分子，在细胞增殖、凋亡、脂肪代谢等方面发挥一系列的调控作用，成为近年来各种临床疾病诊疗、发病机制、预后预测的研究热点。国内外学者通过实时荧光定量PCR、高通量芯片等技术发现多种miRNAs 在人与动物的各种疾病中差异表达，其中miR-143、miR-21 被证实在HBV 相关性肝病中异常表达[5，6]。但关于二者对肝纤维化早期诊断价值的相关研究较少。故本研究以2019 年6 月～2020 年6 月收治的89 例CHB 患者为研究对象，分析血清miR-143、miR-21 对HBV 相关性肝纤维化的早期诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2019 年6 月～2020 年6 月在我院就诊的CHB 患者89 例作为疾病组。纳入标准：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 年更新版）》[7]诊断标准，且经皮肝组织活检确定肝纤维化分期≤S1 期；②入院前6 个月内未接受相关治疗；③年龄≥18 岁。排除标准：①排除存在非HBV 造成的其他肝病毒感染者；②存在肝癌、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等其他肝脏炎症者；③伴有肝血管瘤、血吸虫肝病者。另选取年龄、性别相匹配的健康体检者90 例作为对照组。疾病组中男50 例，女39 例，年龄19～65 岁，平均（35.52±10.23）岁；对照组中男47 例，女43 例，年龄18～65 岁，平均（35.60±12.12）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究开展前受试者均知情同意且签署知情同意书，研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》伦理道德标准。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-143、miR-21 检测收集患者检验室剩余血液，分离血清后以RNA 提取试剂盒提取RNA，经逆转录试剂盒获得cDNA，按照试剂盒说明书设定反应体系（试剂盒均购于广州赛百纯生物科技有限公司），反应条件：95℃预变性3min，95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸28s，重复35 个循环，72℃延伸5min，以U6 为内参，2-△△Ct为目的基因的相对表达量，引物序列miR-143：5'-TAGCTATCGATGACGATACGCGCT-3'（F），5'-G TGTATATCAGCGTAACGATCCA-3'（R）；miR-21：5'-ACTCTACTGTATAAGCTCTGA-3'（F），5'-CAGC TATGCATCTACTACGGC-3'（R）；U6：5'-TCCCATC GATTACGTAGCCGAGCT-3'（F），5'-GGCAATCAGA ATACCTGTGTATC-3'（R）。

1.2.2 其他血清生化指标检测 收集患者检验室剩余血液4mL，以BC-5000 全自动血液细胞分析仪（迈瑞生物医疗电子股份有限公司）检测天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、白蛋白（Albumin，ALB）、总胆红素（Total bilirubin，TBil）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glu-tamyltranspeptidase，γ-GT）、凝血酶原时间（Prothrombin time，PT）、白细胞（White blood cells，WBC）、血红蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板（Platelet，PLT）；荧光定量PCR 检测HBV-DNA复制水平，雅培i2000SR 化学发光免疫分析仪及配套试剂检测乙肝五项[乙肝表面抗原（Hepatitis B

surface antigen，HBsAg）、乙肝表面抗体（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝e 抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e 抗体（Hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝核心抗体（Hepatitis B core antibody，HBcAb）]，相关仪器试剂购于美国雅培有限公司（中国）。

1.2.3 肝组织病理学检查 疾病组患者实施肝组织病理学检查，在B 超引导下进行肝脏穿刺获取肝组织标本，至少获得6 个汇管区标本，常规石蜡包埋，由2 名工作经验5 年以上病理科医师对肝脏标本组织进行诊断，按照国际Scheuer 系统标准[8]，肝纤维化程度分为S0 期：无纤维化；S1 期：汇管区纤维化扩大；S2 期：汇管区周围纤维化/纤维间隔形成；S3 期：纤维化伴小叶结构紊乱；S4 期：肝硬化。其中S1 期为肝纤维化早期。

1.2.4 观察指标 包括性别、年龄、饮酒史、吸烟史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、血清生化指标等。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，数据比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；非正态分布数据以四分位数间距[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验，组内两两比较采用Z检验；多因素Logistic 回归分析影响早期HBV 相关性肝纤维化的危险因素；建立受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线，分析血清miR-143、miR-21 对早期HBV 相关性肝纤维化的诊断价值，计算ROC 曲线下面积（Area under curve，AUC）。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝功能指标比较与对照组比较，疾病组ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平更高，差异具有统计学意义（P<0.05）；两组PT、ALB 水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 两组肝功能指标比较（）

表1 两组肝功能指标比较（）

2.2 两组血清miR-143、miR-21 水平比较与对照组比较，疾病组S0 期、S1 期miR-143、miR-21 相对表达量更高，差异有统计学意义（P<0.001）；与S0期比较，S1 期miR-143、miR-21 相对表达量更高，差异有统计学意义（P<0.001）。见图1。

图1 血清miR-143、miR-21 表达水平箱型图

2.3 疾病组早期肝纤维化与无肝纤维化患者血清miR-143、miR-21 表达水平及其他因素差异疾病组病理结果显示42 例S1 期（早期纤维化），47 例S0 期（无纤维化）。早期肝纤维化患者AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒载量>1×107copy/mL 占比均高于无纤维化患者，ALB 水平低于无纤维化患者（P<0.05）；两组性别、年龄、饮酒史、吸烟史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、ALT、TBil、γ-GT、PT、Hb、WBC、PLT 水平及HBeAg、HBeAb、HBcAb 阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 两组血清miR-143、miR-21 表达水平及其他因素比较

2.4 影响早期HBV 相关性肝纤维化发生的多因素Logistic 回归分析将单因素分析有统计学差异的自变量纳入多因素Logistic 回归分析，采用向前似然比法，引入变量标准α入=0.05，剔除标准α出=0.10，以CHB 患者是否存在早期肝纤维化（无纤维化=0，有早期纤维化=1）为因变量，进入Logistic回归分析模型，结果显示：miR-21、miR-143、HBVDNA 病毒载量>1×107copy/mL、ALP 是影响早期HBV 相关性肝纤维化的危险因素（P<0.05）。见表3。

表3 影响HBV 相关性肝纤维化早期发生的多因素Logistic 回归分析

2.5 血清miR-143、miR-21 对早期HBV 相关性肝纤维化的诊断价值ROC 曲线显示：血清miR-143 联合miR-21 诊断早期HBV 相关性肝纤维化的灵敏度、约登指数、AUC 均大于血清miR-143 与miR-21 单独诊断。见表4、图3。

图3 血清miR-143、miR-21 诊断早期HBV 相关性肝纤维化的ROC 曲线

表4 血清miR-143、miR-21 对早期HBV 相关性肝纤维化的诊断效能

3 讨论

CHB 是我国常见肝脏传染性疾病，目前尚无有效根治措施。资料显示[9]，我国2005～2016 年全国CHB 报告发病率从27.01/10 万上升至60.08/10 万，且≥20 岁人群CHB 报告发病率上升趋势更为明显，对居民健康造成了严重威胁。当机体感染HBV后，进入慢性乙肝期，肝脏的自我损伤修复导致肝纤维化，随着纤维化的持续发展，肝脏修复过程失调，逐渐转化为肝硬化及肝癌，进而危及患者生命[10]。在肝脏纤维化发展的过程中，去除影响肝脏损伤的相关因素，并进行有效地保肝治疗可延缓纤维化进展甚至逆转这一过程，降低肝硬化及肝癌等严重肝脏病变风险[11]。因此，在肝纤维化早期明确肝纤维化进程的影响因素并及时进行有效的诊断，监测病情进展，以采取针对性的治疗方案是改善预后的关键。

近年来miRNAs 的表达差异逐渐成为各种疾病的相关研究热点，并成为早期诊断及病情监测的有效预警性标志。miRNAs 能特异性地与靶mRNA 的3'端非翻译区结合，调控相关基因的表达，参与胚胎的发育、感染与防御，细胞的增殖、凋亡、脂肪的代谢等生命活动[12]。miR-143 与miR-21 是miRNAs 成员，均参与肝脏疾病的发生发展。Zhang 等[13]采用TaqMan 低密度阵列和实时定量PCR 技术，在HBV 肝硬化、正常肝脏和肝细胞癌组织中筛选了差异表达的miRNA，认为miR-143 可用于HBV 早期诊断、肝硬化及总生存期预测。朱锦宏等[14]研究发现，miR-143 在HBV 相关肝病患者中有异常表达，其在健康对照者、慢性乙肝、乙肝肝硬化、乙肝肝癌患者中的表达量逐渐升高，提示miR-143 与乙肝相关肝病患者病情进展有关。另有研究[15]发现，miR-143 启动子中rs4705342 多态性可通过改变HBV 诱导的核因子κB 信号通路相关蛋白表达，从而引起HBV 感染，并促进乙肝相关性肝癌的发生。Dundar 等[16]发现miR-21 的过表达与HBV 介导的肝细胞癌肝移植患者复发有关。Jiang 等[17]认为miR-21 水平与肝脏代偿失调的程度密切相关，可用于评估肝硬化严重程度。本研究结果中，疾病组ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平及miR-143 与miR-21 相对表达量均高于对照组，证实miR-143、miR-21 在CHB 患者中异常表达。

本研究通过单因素分析发现疾病组发生早期肝纤维化患者的AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒载量>1×107copy/mL 占比均高于无纤维化患者，ALB 水平低于无纤维化患者。进一步行多因素Logistic 回归分析显示miR-21、miR-143、HBV-DNA 病毒载量>1×107copy/mL、ALP 是影响早期HBV 相关性肝纤维化的危险因素，说明miR-21、miR-143 的异常表达可增加早期HBV 相关性肝纤维化的发生风险。HBV 相关性肝纤维化的病理变化表现为HBV 感染后在肝脏进行大量的复制，刺激机体免疫系统的病毒清除机制，引发免疫炎性损伤，导致肝细胞的损害，随之肝脏组织进行自我修复，这一过程导致肝脏内纤维结缔组织异常增生，进而发生肝纤维化[18]。而miR-143、miR-21 均可通过调控相关信号通路，参与肝纤维化的发展，因此其表达水平的异常可导致相关信号通路调控失衡，促进肝纤维化的发生。此外本研究中ROC曲线分析结果显示，miR-143 与miR-21 联合诊断早期HBV 相关性肝纤维化的灵敏度、约登指数与AUC 均大于单独诊断，提示miR-143 联合miR-21 对早期HBV 相关性肝纤维化的诊断效能较好。miRNAs 在血液中的稳定性较好，具有重复性和特异性高的特点，可考虑将miR-143 与miR-21 作为监测早期HBV 相关性肝纤维化发生的生物学标志物。

综上所述，血清miR-143、miR-21 在CHB 患者中异常表达，且二者均是影响早期HBV 相关性肝纤维化发生的相关因素，对早期HBV 相关性肝纤维化有较高的诊断价值，可考虑作为诊断早期HBV 相关性肝纤维化的生物学标志物。