兔腰椎间盘严重退变骨水泥成形术模型建立与鉴定

蔡碰德 顾恩毅 潘伟坤 陈康尧 郑 忠

厦门大学附属福州第二医院骨科（福州 350007）

随着年龄的增加，椎间盘由于老化和机械损伤而发生生物力学和结构变化导致的腰腿疼痛在老年患者中十分常见［1］，尤其是存在腰椎不稳定的患者通常需摘除责任节段椎间隙髓核、置入椎间融合器并采用椎弓根螺钉内固定，手术创伤大、出血量大、手术时间长，高龄患者常因存在高血压、冠心病、糖尿病等基础疾病不能耐受开放大手术，且手术期间容易出现相关并发症［2-3］，严重影响其生活质量。针对上述的临床情况，近年来国外有学者介绍了经皮骨水泥椎间盘成形术（percutaneous cement discoplasty，PCD），该技术可经皮注射聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（polymethyl methacrylate，PMMA）填充于严重退变的椎间盘中。这一新型手术方式提供了迅速的节段稳定效果且因椎间孔增大的而达到神经根及硬膜囊间接减压的效果，具有较为肯定的临床治疗效果［4-5］。然而，将该技术在临床上广泛应用还需还大量的动物实验及临床随访来证明，建立一种可行性强、可重复性好的实验动物模型用于后期的研究十分必要。本研究通过采用锐性切开实验兔纤维环、破坏髓核并饲养6周的方法首先造成椎间盘严重退变，而后向椎间隙注射骨水泥建立兔腰椎间盘骨水泥成形术的动物模型，并应用X线、MRI进行验证。

1 材料与方法

1.1 实验动物及造模前影像学检查

选用体质量1.5～2.5 kg的清洁级健康雄性5月龄新西兰大白兔6只（福建中医药大学动物实验中心提供并饲养）。适应性饲养1周后在经面罩气体全身麻醉下拍摄X线片并行MRI检查，步骤如下：首先将实验动物放置于小动物麻醉诱导箱中，采用浓度99.9%异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司提供）进行诱导麻醉，流量为4.5～5 L /h。诱导成功后将小动物转移至固定平台，通过小动物（兔）专用面罩经气道给予全身麻醉，99.9%异氟烷，流量为2.0～2.0 L /h，根据麻醉的深度及时调整麻醉剂流量。所用小动物麻醉机由深圳瑞沃德生命科技有限公司提供，型号为540I。麻醉生效后采用移动式X射线机（GE OEC Fluorostar Compact，通用电气OEC医疗系统公司，美国）拍摄以腰2～3为中心兔腰椎正侧位X线片。而后应用小动物磁共振（GE Signa Advantage 115 T，通用电气OEC医疗系统公司，美国）对兔腰椎2～3节段行T2加权像（T2WI）扫描。扫描参数如下：序列重复时间/ 回波时间（TR/ TE）T2WI为5 000/ 128 ms，层厚1 mm，层间距1 mm，所有MRI影像资料由三位资深MRI医师在不同的时间盲法阅片并按Pfirrmann分级［6］法进行评估分级，共分为Ⅰ～Ⅴ级，意见不一致时通过讨论定级。本研究动物实验方案经厦门大学附属福州第二医院伦理委员会审批通过（伦理批件号：FZEYLL2020010015）。

1.2 椎间盘严重退变模型建立及鉴定

适应性喂养1周后参考课题组前期的手术造模经验［7-8］，诱导成功后将小动物转移至动物手术台上固定四肢。采用侧卧位，腰部下方垫一厚度约6.0 cm的软垫使术侧腰椎间隙增大，术侧躯干冠状面与手术台水平面成45°。采用小动物麻醉机面罩吸入麻醉，所使用麻醉剂及麻醉方法同前所述。

手术造模步骤具体如下：全身麻醉生效后，剔除手术区域毛发，常规碘伏消毒并铺无菌洞巾，触及实验兔肋弓，以平肋弓下缘（约平腰2～3椎体间隙平面）后正中旁开约1.5 cm处为做一长约4.0 cm的纵向切口。逐层切开皮肤、皮下组织及筋膜，识别腹外斜肌外侧缘与腰背肌间隙并钝性分离该间隙，手术拉钩前后拉开间隙，触及肋骨辨别胸12椎体，向下推移2个椎体即为腰2～3椎体间隙。拉钩牵拉腰2椎体横突，另一拉钩下压腹膜及腹腔脏器，剥离椎体前缘的软组织显露腰2～3椎体间隙侧前方。在腰2～3椎体间隙侧前方用20号尖刀片沿脊柱纵轴逐层切开前纵韧带、纤维环，用20 mL注射器针头刺入椎间盘内并轻微挑拨直至见部分胶冻样半透明的髓核组织溢出，用微型牙科用小刮匙剔除大部分髓核组织。冲洗切口，缝合腰背肌及腹外斜肌的筋膜及皮肤，无菌敷料覆盖手术切口，终止吸入麻醉，实验动物送入动物房麻醉复苏继续饲养。

饲养6周后腰椎手术节段行磁共振检查，具体方法及所用仪器设备同前所述。影像学检查腰椎间盘MRI的Pfirrmann分级为Ⅴ级者的动物进入下一个步骤：椎间盘严重退变骨水泥注射模型建立。

1.3 椎间盘严重退变骨水泥注射模型建立及鉴定

1.3.1 椎间盘严重退变骨水泥注射模型建立 上述影像学表现符合腰椎间盘突出严重退变的实验兔行第二次手术，本次手术麻醉方法、显露方法同前所述，显露至腰2～3间隙椎间盘部位。清除手术节段周围的瘢痕组织，利用微型撑开器撑开实验兔腰2～3间隙，通过注射器往椎间盘注入约0.5 mL骨水泥（PALACOS®，德国），待骨水泥凝固后逐层闭合手术切口，终止吸入麻醉，实验动物送入动物房麻醉复苏。（手术操作示意图见图1）。

图1 手术操作示意图

1.3.2 椎间盘严重退变骨水泥注射模型鉴定 椎间盘严重退变骨水泥注射模型1周后拍摄手术节段X线片并行磁共振检查及Pfirrmann分级，具体方法及仪器设备同前。上述影像学检查完成后经耳缘静脉注入空气处死实验兔，解剖显露腰2～3椎间隙，探查了解手术部位的骨水泥有无脱落、松动。

2 结 果

椎间盘严重退变骨水泥注射模型1周后拍摄手术节段X线片，结果显示骨水泥较好地填充于腰2～3间隙，椎间隙高度接近正常状态（见图2）。而MRI扫描Pfirrmann分级显示6例实验兔椎间盘严重退变模型建立后腰2～3椎间盘信号T2WI椎间盘髓核信号强度Pfirrmann分级均为Ⅴ级，椎间盘内注射骨水泥后Pfirrmann分级均为Ⅳ级。终末解剖处实验动物显露腰2～3椎间隙，探查了解手术部位间手术节段的骨水泥有无脱落、松动。以上结果提示本实验进行的腰椎间盘严重退变骨水泥模型切实可行，可重复性好。

图2 腰2～3正侧位X线片（白色箭头指示为填充的骨水泥）

3 讨 论

随着社会的老龄化，因椎间盘严重退变引起腰腿痛是老年患者较为常见的脊柱脊髓疾病，严重影响老年患者的生活质量甚至其寿命，越来越受到众多脊柱外科医师及患者的重视。既往传统的手术治疗方法常需行腰椎责任节段切开椎间隙融合椎弓根内固定，然而老年患者常合并高血压、糖尿病、冠心病等基础疾病不能耐受而只能接受疗效不切确的非手术治疗方法。近几年内国内外从事脊柱外科专业的学者报道采用经皮椎间盘骨水泥成形技术来解决上述的难题，并取得不错的临床近期效果。该项技术通过类似于经皮椎体成形术通过经皮微创往责任间隙椎间盘（椎间盘严重退变）注入适量骨水泥，使得术前不稳定的责任间隙迅速达到稳定状态。然而这一技术的推广还需要大量的动物实验及临床病例来证明，本课题研究旨在建立一种可行性强、可重复性好的实验动物模型以便用于后期的生物力学、组织学等基础研究。

3.1 实验动物与手术干预节段的选择

本课题研究在先前研究的基础上选取新西兰大白兔这一实验动物，相较于中大型动物［9-10］该动物模型饲养容易、来源丰富、价格适中。前期课题实验已证实新西兰大白兔手术造模采用呼吸道吸入麻醉效果满意，安全性高。手术造模发现其椎间盘大小合适，可通过针刺、切开纤维环使髓核组织流出人为造成椎间盘退变，后期可进行纤维环缝合、向椎间隙注入骨水泥、生物凝胶等操作，实验可操作性强。本动物模型之所以选择兔腰2～3间隙水平作为手术干预节段，原因在于手术操作时可以胸12的肋骨作为触摸的解剖标志，向下识别腰1、2椎体较为准确定位手术节段，此外选择在腰2～3椎间隙水平进行可尽量减少肋弓遮挡对手术显露目标椎间盘及后续操作的影响。

3.2 本实验模型的难点

本实验模型在前期的基础上实验动物术前麻醉、手术部位显露已较为成熟，造模过程中未出现一例实验动物意外死亡，课题组成员手术造模显露相应腰椎节段时间平均不超过20分钟。然而，在前期预实验造模过程往椎间隙内注入骨水泥这一步骤中遇到一定的困难。由于受动物体型大小的影响新西兰大白兔腰椎间隙较为狭小，而骨水泥具有一定的粘稠度，通过细小的注射器将骨水泥推入兔腰椎间隙较为困难。后期进行了以下改进：①切除骨水泥注射部位的部分纤维环；②使用微小刮匙去除大部分的髓核组织及部分椎间盘终板软骨；③注射骨水泥时使用微型撑开器撑开椎间隙便于骨水泥更好地进入椎间隙。经过改进后骨水泥能较为顺利地注入兔腰2～3椎间隙中。

3.3 模型制备成功的鉴定

本模型制备是否成功主要分为两部分，第一部分是椎间盘是否发生严重退变，课题组前期的研究已表明MRI特别是其在T2系列上的信号变化能够较好地反映腰椎间盘在退变过程中形态、生物化学的变化［11-12］。本课题也证实了手术干预椎间盘6周后MRI椎间盘信号Pfirrmann分级由造模前Ⅰ级变为Ⅴ级，说明本实验椎间盘严重退变模型建立成功。第二部分是椎间盘骨水泥注射是否成功，本实验通过三个方面加以验证：①术后拍摄实验兔腰椎正侧位X线片证实骨水泥位于腰2～3椎间盘内，位置良好；②磁共振扫描证实腰2～3椎间盘T1及T2系列信号改变符合骨水泥填充影像学改变；③最后动物处死解剖证实所注射入骨水泥位于椎间盘内无松动或者脱落。

3.4 展望

在本课题研究模型建立成功的基础上，后期研究可针对比较实验兔腰椎间盘骨水泥注射后生物力学、影像学、组织学等展开相关研究，进一步明确该项新技术的可行性。此外，本课题采用传统开放手术建立动物模型，创伤较大，后期可尝试以微创通道建立兔椎间盘严重退变模型，并向其椎间隙注射骨水泥。这种微创方式可能为临床采用类似椎体成形术微创方式治疗老年患者严重椎间盘退变引起的脊柱脊髓疾病提供动物实验基础。